ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНА KELL ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2005 года по МПК A61K39/00 G01N33/53 

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к препаратам на основе моноклональных антител, и касается тест-систем для определения антигенов эритроцитов человека, в частности определения антигена Kell (ISBT KEL1 №006001*. Порядковый номер антигена Kell по международной классификации ISBT (International Society of Blood Transfusion), 1985).

Область применения этой тест-системы достаточно широка. Ее используют для подбора совместимых пар донор-реципиент при переливании крови и трансплантации костного мозга, диагностики гемолитической желтухи новорожденных, судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств и других прикладных и научных целей.

В тест-системах для определения антигена Kell обычно используют сыворотки анти-Kell, полученные из крови лиц, иммунизированных антигеном Kell в результате гемотрансфузии или беременности. Однако этот источник не может в настоящее время удовлетворить возросшую потребность лечебно-профилактических учреждений в этом диагностическом реактиве.

Более перспективным для производства и использования в медицинской практике являются другой источник - культуральная среда перевиваемых клеточных линий, способных продуцировать необходимые анти-Kell антитела in vitro в неограниченном количестве.

За рубежом моноклональные анти-Kell антитела выпускают фирмы Ortho BioVue Systems (Англия), Sanofi Diagnostics Pasteur (Франция), Behringwerke (Германия).

В России штамм анти-Kell продуцентов выделен нами впервые. Штамму присвоено наименование KEL1-D/D98.

Известны две тест-системы для определения антигена Kell эритроцитов человека.

Первая тест-система [1] основана на использовании моноклональных анти-Kell антител, которые получают путем иммунизации мышей гликопротеином, выделенным из оболочки эритроцитов, содержащих антиген Kell.

Вторая тест-система [2], являющаяся наиболее близким прототипом предлагаемого изобретения, основана на использовании моноклональных анти-Kell антител, которые получают посредством культивирования лимфобластоидных клеток человека, трансформированных вирусом Эпштейн-Барра. Способ получения сводится к следующему. Из периферической крови человека, иммунизированного Kell антигеном, выделяют лимфоциты, которые затем помещают в среду, содержащую указанный вирус. Инфицированные лимфоциты трансформируются в перевиваемые клеточные линии. Далее производят отбор штамма, который продуцирует антитела требуемой активности.

Однако антитела, получаемые с помощью указанной технологии, имеют широкую специфичность и реагируют с эритроцитами в нескольких тест-системах, предназначенных как для реакции полных, так и неполных антител. Это может представлять определенные неудобства, особенно в тех случаях, когда необходима точная эпитопная характеристика исследуемых антигенов и антител.

Кроме того, указанная технология не предусматривает гибридизацию иммунных лимфоцитов с клетками мышиной миеломы. Между тем гетерогибридизация клеток является методическим приемом, который позволяет с большей степенью вероятности получить перевиваемую клеточную линию.

В связи с этим целью предлагаемого изобретения явилась разработка тест-системы, включающей антитела, обладающие более узкой специфической направленностью.

Указанная цель достигалась путем гибридизации лимфоцитов человека, предварительно иммунизированного Kell антигеном, с клетками мышиной миеломы.

Сущность предлагаемого изобретения

Сущность предлагаемого изобретения заключается в разработке тест-системы для определения антигена Kell эритроцитов человека, включающей моноклональное антитело к антигену Kell эритроцитов человека, представляющее собой неполные сенсибилизирующие IgG антитела, реагирующие с Кеll+ эритроцитами в непрямой реакции Кумбса с титром не менее 1:128, и общепринятые вспомогательные вещества.

Второй аспект предлагаемого изобретения заключается в получении моноклонального антитела к антигену Kell эритроцитов человека, представляющего собой неполные сенсибилизирующие Kell-антитела, реагирующие с Кеll+ эритроцитами в непрямой реакции Кумбса и продуцируемые разработанной нами гибридомой под регистрационным номером 001/2002-KEL1-D/D98 в коллекции клеточных культур НИИ переливания крови Гематологического научного центра РАМН.

Третий аспект состоит в том, что полученное моноклональное антитело, в отличие от известных, имеет более узкую специфичность, то есть не агглютинирует эритроциты в солевой среде, но вызывает выраженную агглютинацию на плоскости при добавлении коллоидов.

Четвертый элемент предлагаемого изобретения связан с гетерогибридомой, продуцирующей моноклональное антитело к антигену Kell эритроцитов человека, отличающейся тем, что она представляет собой культуру клеток, полученную посредством слияния иммунных лимфоцитов человека и клеток мышиной миеломы, зарегистрированную под номером 001/2002-KEL1-D/D98 в коллекции культур НИИ переливания крови Гематологического научного центра РАМН.

Дополнительно изобретение включает получение гетерогибридомы, которая экспрессирует антигены HLA II класса - HLA-DRB1*7, HLA-DRB1*12.

Другим дополнительным элементом является использование предлагаемой тест-системы для определения антигена Kell в эритроцитах человека с помощью реакции агглютинации на плоскости.

Предлагаемая тест-система принципиально отличается от известных ранее. Как уже указывалось выше, она основана на использовании антител, которые получают посредством культивирования гетерогибридомы человек-мышь. Для получения гетерогибридомы берут лимфоциты человека, искусственно иммунизированного Kell положительными эритроцитами, и гибридизируют посредством слияния их с клетками мышиной миеломы. Затем отбирают гибриды, продуцирующие анти-Kell антитела. Далее культуральную жидкость, содержащую антитела, смешивают с коллоидами [3] и используют для определения антигена Kell в эритроцитах человека методом прямой агглютинации на плоскости при комнатной температуре [4].

Примеры осуществления изобретения

Пример 1

Из периферической крови Kell отрицательного донора, искусственно иммунизированного Kell положительными эритроцитами, обработанными протеолитическим ферментом протелином (проназой С), выделяют лимфоциты посредством центрифугирования в градиенте плотности фиколл- или полиглюкин-верографина [5]. Удельная плотность раствора 1076-1077.

Далее лимфоциты сенсибилизируют вторично in vitro Kell положительными эритроцитами, смешивают с клетками мышиной миеломы P3-X63-Ag.8.653 и полиэтиленгликолем-1500, затем культивируют в селективной среде ГАТ и клонируютпосредством лимитирующих разведений до получения 100% антителобразующих клеток.

Соотношение миеломных клеток мыши и мононуклеарных клеток человека при слиянии - 1:1. После слияния гибриды клеток культивируют в 96-луночных платах из расчета 5-10 клеток на лунку. Эффективность гибридизации должна составлять не менее 30%. Культивирование производят на фидере из тимоцитов человека, рассаживание - 1:2 через 2 суток.

Для культивирования используют среду ДМЕМ, содержащую 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 4 мМ L-глутамина, 2 мМ пирувата натрия, 10 мМ HEPES-буфера, антибиотики. Концентрация СО₂ должна составлять 5,2%, влажность - 100%, температура - 37°С.

Штамм выделяют после 2-3 кратного клонирования. Число пассажей штамма - более 15.

Хранение штамма: клеточную взвесь замораживают при -70°С в среде из 90% сыворотки, 10% ДМСО и хранят в течение суток, затем переносят в жидкий азот для долгосрочного хранения. Жизнеспособность клеток после размораживания через 3 года - около 70%.

Характеристика полученного штамма

Штамм KEL1-D/D98 хранится в коллекции перевиваемых клеточных линий Института переливания крови Гематологического научного центра Российской академии медицинских наук под №001/2002-KEL1-D/D98 и характеризуется следующими признаками.

Клетки имеют 86-90 хромосом, экспрессируют антигены HLA II класса - HLA-DRB1*7, HLA-DRB1*12. Кариотип представлен видами Mus musculus и Homo hominis.

Штамм не содержит бактерий, плесеней, микоплазмы. Реакции на сифилис отрицательные. Вирусы гепатита, иммунодефицита человека не обнаружены.

Антитела, продуцируемые штаммом, относятся к IgG классу, реагируют с эритроцитами человека, содержащими антиген Kell в непрямой антиглобулиновой пробе и не реагируют с эритроцитами, не содержащими антигена Kell. Титр антител анти-KEL1 в культуральной жидкости 1:128. Стабильность антител образования - более 15 пассажей.

Особенности штамма: гетерогибридома KEL1-D/D98 продуцирует моноклональные антитела, отличающиеся от существующих зарубежных аналогов более узкой направленностью. Они относятся к неполным (сенсибилизирующим) антителам - не агглютинируют эритроциты в солевой среде, но вызывают выраженную их агглютинацию на плоскости при добавлении коллоидов (табл.1). В то же время сравниваемые зарубежные образцы моноклональных антител имеют признаки неполных и полных антител одновременно - агглютинируют эритроциты в солевой и коллоидной среде, проявляя более широкую специфическую направленность.

Антитела, продуцируемые штаммом KEL1-D/D98, подобно классическим иммунным неполным антителам хорошо выявляются в непрямой антиглобулиновой пробе Кумбса и реакции агглютинации в коллоидной среде на плоскости, но в то же время почти не реагируют в реакции конглютинации с 10% желатином.

Таблица 1
Специфичность и активность моноклональных антител, продуцируемых гетерогибридомой KEL 1-D/D98ЭритроцитыТитр моноклональных анти-KEL1 антителKEL1-D/D98Sanofi Diagnostics Pasteur [Ortho Bio Vue Systems]в солевой средев коллоидной среде на плоскостив пробе Кумбсав солевой среде, в том числе на плоскостис 10% желатиномв пробе Кумбса0(I)CcDEeKk01:1281:2561:128 [1:256]1:256 [1:512]1:512 [1:1024]0(I)CcDEekk0000000(I)ccDEeKK01:128±2561:2561:128±256 [1:256±512]1:256 [1:512]1:512 [1:1024]0(I)CCDEekk000000A(II)CCDEekk000000B(III)CCDEekk000000Примечание. В квадратных скобках приведен титр анти-Kell антител производства фирмы Ortho Bio Vue Systems (Англия).

Пример 2

Использование тест-системы для определения антигена Kell в эритроцитах человека непрямой реакцией Кумбса

Культуральную жидкость гетерогибридомы KEL1-D/D98, отделенную от клеток и консервированную азидом натрия (1 г/л), в количестве 0,1-0,2 мл смешиваютв пробирке с 0,03-0,05 мл исследуемых трижды отмытых 0,9% NaCl эритроцитов и помещают в термостат при 37°С на 25 мин [6]. Затем эритроциты вновь трижды отмывают и испытывают с антиглобулиновой сывороткой. Агглютинация эритроцитов свидетельствует о наличии в эритроцитах антигена Kell, отсутствие агглютинации указывает на то, что эритроциты не содержат этого антигена.

Пример 3

Использование тест-системы для определения антигена Kell в эритроцитах человека экспресс-методом на плоскости при комнатной температуре

Культуральную жидкость гетерогибридомы KEL1-D/D98, отделенную от клеток и консервированную азидом натрия (1 гр/л), смешивают с коллоидными растворами [3], после чего 2 капли (0,05-0,1 мл) смеси помещают на фарфоровую пластинку и смешивают с 0,03-0,05 мл исследуемых эритроцитов [4]. Наблюдение за ходом реакции продолжают до истечения пяти минут, после чего учитывают результат. Агглютинация эритроцитов свидетельствует о наличии в эритроцитах антигена Kell, отсутствие агглютинации указывает на то, что эритроциты не содержат этого антигена (см. чертеж).

Таким образом, использованные нами новые методические приемы позволили создать тестовой реактив для определения антигена Kell эритроцитов человека экспресс-методом на плоскости при комнатной температуре, который может производиться in vitro в неограниченных объемах.

Список источников информации

1. Jaber A., Loirat M., Willem С., Cartron J., Blanchard D. Characterization of murine monoclonal antibodies directed against the Kell blood group glycoprotein. Br. J. Haematol., 1991 Oct., v.79, №2, p.311-315.

2. Jaber A., Blanchard D., Goossens D., Bloy C., Lambin P., Salmon C., Cartron J. Characterization of blood group Kell (K1) antigen with a human monoclonal antibody. Blood, 1989, May 1, v.73, №6, р.1597-1602.

3. Донсков С.И., Пискунова Т.M., Каландаров Р.С. и др. Способ приготовления сыворотки анти-Kell для экспресс-метода. Патент №2182710, приор. 12.03.2001, Бюл. №14, 2002.

4. Донсков С.И., Башлай А.Г., Пискунова Т.M., Червяков В.И., Липатова И.С. Инструкция по определению антигена Kell экспресс-методом на плоскости. В кн.: Иммуносерология (нормативные документы), составители Башлай А.Г., Донсков С.И. M., 1998, с.141-142.

5. Красавцева Т.К., Манишкина Р.П., Донсков С.И. Получение лимфоцитов из периферической крови с помощью полиглюкина и верографина. Лаб. дело, 1977, №2, с.67-68.

6. Исследование сыворотки на наличие неполных резус-антител непрямой пробой Кумбса. В кн.: Иммуносерология (нормативные документы), составители Башлай А.Г., Донсков С.И. M., 1998, с.115-117.

Изобретение относится к медицине и касается тест-систем для определения антигенов эритроцитов человека, в частности определения антигена Kell (ISBT KEL1 №006001). Сущность состоит в том, что путем слияния иммунных лимфоцитов человека и мышиной миеломы получен штамм перевиваемых гибридных клеток KEL1-D/D98, продуцирующих моноклональные анти-Kell антитела с титром 1:128. Объектом изобретения являются также антитела, которые специфически реагируют с эритроцитами, содержащими антиген Kell. С эритроцитами, не содержащими антигена Kell, они не реагируют. Технический результат состоит в том, что в отличие от существующих моноклональных анти-Kell антител полученные антитела обладают более узкой специфичностью: реагируют с Kell+эритроцитами в непрямой пробе Кумбса, реакции агглютинации на плоскости в присутствии коллоидов, однако почти не реагируют в реакции конглютинации с 10% желатином и реакции агглютинации в солевой среде. 4 н. и 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл.

1. Тест-система для определения антигена Kell эритроцитов человека, включающая моноклональное антитело к антигену Kell эритроцитов человека, представляющая собой неполные сенсибилизирующие IgG антитела, реагирующие с Кеll+ эритроцитами в непрямой реакции Кумбса с титром не менее 1:128 и общепринятые вспомогательные вещества.2. Моноклональное антитело к антигену Kell эритроцитов человека, представляющее собой неполные сенсибилизирующие Kell-антитела, реагирующие с Кеll+ эритроцитами в непрямой реакции Кумбса и продуцируемые гибридомой под регистрационным номером 001/2002-KEL1-D/D98 в коллекции клеточных культур НИИ переливания крови Гематологического научного центра РАМН.3. Моноклональное антитело по п.2, отличающееся тем, что оно не агглютинирует эритроциты в солевой среде, но вызывает выраженную агглютинацию на плоскости при добавлении коллоидов.4. Гибридома, продуцирующая моноклональное антитело к антигену Kell эритроцитов человека по п.2 или 3, отличающаяся тем, что она представляет собой культуру клеток, полученную посредством слияния лимфоцитов человека и клеток мышиной миеломы, зарегистрированная под номером 001/2002-KEL1-D/D98 в коллекции клеточных культур НИИ переливания крови Гематологического научного центра РАМН.5. Гибридома по п.4, отличающаяся тем, что она экспрессирует антигены HLA II класса - HLA-DRB1*7, HLA-DRB1*12.6. Способ выявления антигена Кеll эритроцитов человека в реакции агглютинации, отличающийся тем, что используют тест-систему по п.1.