Штамм культивируемых клеток человека - продуцент многоклональных антител к Д-антигену системы резус человека Советский патент 1991 года по МПК C12N5/18 C12P21/08 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для определения резус-принадлежности крови и для профилактики сенсибилизации резус-отрицательных женщин при резус-несовместимости беременности.

Цель изобретения - создание штамма культивируемых клеток человека, продуцирующих моноклональные антитела (Моп-АТ) к D-антигену системы резус человека.

Штамм культивируемых клеток получают следующим образом.

Лимфоциты периферической крови иммунного донора инкубируют с вирусом, затем культивируют в 96-ячеечных круглодонных платах по 30 тыс. клеток на Ячейку с циклоспорином А для предотвращения цитотоксического воздействия Т-кле- ток. Для получения линии наращивают кл ет- ки из ячеек с максимальным ростом, и максимальным титром антител к D-антигену, способных выявлять также Ои-антиген. Штамм-продуцент получают в результате однократного клонирования линии методой лимитирующих разведений.

Штамм D-89/H6 депонирован под номером ВСКК(П)390Д во Всесоюзной коллекции клеточных культур и имеет следующие характеристики.

Морфологические признаки. Суспензионная культура состоит из клеток, собранных в шарообразные аггломераты.

Цитогенетические признаки. Нормальный кариотип человека, 46 XX,

о VJ

00 00

00

о

Культуральные свойства. Среда для культивирования RPM 1640, с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 4 мМ 1-глута- мина, 2% HEPES-буфера, антибиотики; 37°С, 5% С02 в воздухе. Частота пассирования 3-4 сут, кратность рассева 1:2-1:3. Титр антител в культуральной жидкости, определяемой в пря,мой реакции агглютинации D + эритроцитов, обработанных бромелином, составляет 1:4096.

Характеристика моноклональных антител. Моноклональные антитела, секретиру- емые штаммом D-89/H6, выявляют D-антиген эритроцитарной мембраны и его слабые формы (0й); относятся к классу G-им- муноглобулинов.

Способ криоконсервирования. Криоза- щитная среда: 50% ростовой среды, 40% сыворотки, 10% диметилсульфоксида. Клетки в криозащитной среде помещают на сутки при -70°С, после чего переносят в жидкий азот, Жизнеспособность после размораживания 85-90%; культивирование после размораживания в плотности 0,4-0,5x106 клеток/мл.

Бактерии, грибы, дрожжи и микоплазмы не обнаружены. Вирусы не тестированы.

Проводят сравнение активности моноклональных антител D-89/H6 и поликло- нальных анти-О-антител в различных серологических тестах.

В табл. 1 приведены результаты сравнения моноклональных антител, секретируе- мых линией D-89/H6, с отечественными полмклональными изоиммунными сыворотками и полмклональными типирующими реагентами и моноклональными препаратами зарубежного производства в непрямом антиглобул и новом тесте и конглютинации с желатиной со стандартными D + эритроцитами.

В табл. 2 приведены сравнительные результаты по выявлению слабых форм D-антигена (D) в непрямом антиглобулиновом тесте с анти-моноклональными антителами D-89/H6, стандартными поликлональными сыворотками отечественного происхождения и зарубежными коммерческими моно- и поликлональными реагентами.

Результаты, приведенные в табл. 1 и 2 показывают, что моноклональные антитела D-89/H6 как по титру, так и по авидности не

уступают или превосходят поликлональные отечественные и зарубежные сыворотки при выявлении нормально выраженного D- антигена и превосходят зарубежные коммерческие препараты при выявлении

Ои-антигена,

Таким образом, на основе моноклональных антител, секретируемых штаммом D-89/H6, возможно создание высокоактивного и высокоспецифичного анти-0-реагента. Моноклональные антитела D-89/H6 стабильны, их титр в препарате не снижается в процессе длительного хранения.

Применение моноклональных антител D-89/H6 приведет к значительному экономическому и социальному эффекту за счет отмены затрат на получение поликлональ- ных изоммунных сывороток, снижения числа ошибок в трэнсфузионной практике. Применение анти-О-моноклонального препарата позволит осуществлять профилактику сенсибилизации резус-отрицательных женщин резус-положительными эритроцитами плода, что приведет к резкому сниже- нию числа тяжелых гемолитических

осложнений и позволит предотвратить многочисленные случаи гемолитической болезни новорожденных.

Формула изо б.р е т е н и я Штамм культивируемых клеток человека ВСКК(П}-390 Д, - продуцент моноклональных антител к D-антигену системы резус человека.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для определения резус-принадлежности крови и для профилактики сенсибилизации резус-отрицательных женщин при резус-несовместимой беременности. Целью изобретения является создание штамма культивируемых клеток человека, продуцирующих монокло- нальные антитела (Мон-АТ) к D-антигену системы резус человека. Линия получена в результате трансформации вирусом Эпш- тейна-Барр лимфоцитов периферической крови резус-отрицательного донора, иммунного против D-антигена. Штамм получил название D-89/H6 и депонирован под номером ВСКК(П) 390Д. Мон-АТ относятся к иммуноглобулинам класса Сив стандартных серологических тестах позволяют с высокой чувствительностью выявлять D-антиген и его слабые формы (0й), что часто невозможно с помощью стандартных изо- иммунных сывороток. Условия культивирования типичны для гибридов, титр Мон-АТ в культуральной жидкости составляет 1:4096. 2 табл. со

45

Таблица 1

Титр антител определяли в непрямом антиглобулиновом тесте в 96-луночных

микроплатах. Суммарный титр - score - является общепринятой характеристикой авидности

антител и отражает выраженность реакции агглютинации. Оценка интенсивности реакции агглютинации: 3+ крупные агглютинаты, 2+ агглютинаты средних размеров, 1+ мелкие агглютинаты.

Продолжение табл.1

Т а б л ч я 2