Штамм гибридных культивируемых клеток MUS мUSсULUS L., используемый для получения моноклональных антител к мембраносвязанной и растворимой формам Н-антигена человека Советский патент 1993 года по МПК C12N5/00 C12P21/08 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для .выявле- нйя Н-антигена на поверхности эритроцитов человека и его растворимой формы в слюне лиц - выделителей.

Известен штамм Н - 86/44, продуцирующий моноклональные антитела (МКА) к мембраносвязанной и растворимой формам Н-антигена человека.

Однако данные антитела обладают недостаточной специфичностью и чувствительностью.

Целью изобретения является получение гидридомы, продуцирующей МКА к мембраносвязанной и растворимой формам Н-антигена человека, обладающие повышенной чувствительностью.

Штамм получают следующим образом.

Самок мышей ДВА/2 х BaL B/cF1 возраста 6 нед. иммунизтлруют пятикратно отмытыми эритроцитами группы О, полученными от нескольких доноров. Первую иммунизацию проводят 50%-ной суспензией эритроцитов в физраство ре й полном адьюванте Фрейнда (0,3 мл внутри- брюшинно и 0,2 мл подкожно). Вторую иммунизацию осуществляют через 2 нед. внутривенно 3%-ной взвесью эритроцитов лпо 0,25 мл/мышь. Через 2 сут. после бус- терной иммунизации сплеНбциты 5 иммун- ных мышей гибридизуют с клетками миеломы мыши РЗ-Х63 Ад8.653, рассеянной за сутки до этого в концентрации 0,45 х 10 кл/мл.

Перед гибридизацией клеточные суспензии трижды отмывают в бессывороточной среде.

б

1 ч

iu

(Л

со

Слияние проводят в 50-мл конических пробирках в присутствии 40%-ного поли- этиленгликоля (мол.масса 3000-3700) в среде DMEM С 15% DMCO в течение 1 мин (300 х 106 спленоцитов и 150 х 106 клеток миело- мы).

Затем в течение 4 мин к клеточной суспензии добавляют 5 мл бессывороточной среды DMEM, а затем доводят объем суспензии до 50 мл средой. DMEM с 2% эмб,- риональной телячьей сыворотки (ЭТС). Клеточную суспензию центрифугируют 8 мин при 800 об/мин, осадок ресуспендиру- ют в полной питательной среде в концентрации 1хЮ6 кл/мл и клетки помещают в 96-ячеечные плоскодонные платы в объеме 0,2 мл (2 х 105 клеток) на ячейку.

Гибридные клетки культивируют в полной питательной среде ДМЕМ с добавлением антибиотиков, 4 мМ глутамина, 20 мМ Хепес-буфера, 1 мМ пирувата натрия, 5 х М 2-меркаптоэтанола и 10 - 20% ЭТС.

Селекцию клонов проводят на среде ГАТ (2% 50 - кратного концентрата в течение 7 сут после слияния). Через 1 нед. при смене половины объема среды вместо ГАТ добавляют 2% 50-кратного концентрата ГТ (среды, содержащей гуанин и ти- мидин).

Скрининг моноклокальных антител (МКА) проводят на 11-18 сут. после слияния методами агглютинации и иммунофермент- ного анализа. В результате тестирования отбирают гибридому Н - 89/8, продуцирующую МКА к Н - антигену на поверхности эритроцитов человека и его растворимой форме. Гибридому клонируют дважды, эффективность клониррвания 92%.

Штамм Н - 89/9 характеризуется следующими признаками.

Культуральные свойства.

Среда культивирования: ДМЕМ с добавлением 3 мм L глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 20 мМ Хепес - буфера, 5 х 10 М 2 - меркаптоэтанола, 10% ЭТС или оленьей сыворотки и антибиотиков. Частота пассирования 1:2 - 1:3 через 2-3 сут. плотность клеток в жидкой среде 3-4 х 10 кл/мя. Клетки выращивают при 37°С, 6%-ном содержании С02 в воздухе и 95-100%-ной влажности. При культивировании In vivo Мышам линии BAL В/с внутрибрюшинно за 7-30 сут. до введения гибридных клеток вводят пристан (0,25 мл). Гибридные клетки инъецируют в количестве 2-3 х 10 /мышь, асцитные опухоли образуются через 12-16 сут.

Морфологические признаки.

Слабоприкрепленные к субстрату клетки с обычной для гибридом морфологией.

Кариологические признаки. Маркерные хромосомы:

1 субтелоцечтрическая и метацентри- ческая. Модельное число хромосом 92 (86-94).

Характеристика полезного продукта: МКА относятся к Ig М. Они выявляют Н-ан- тиген на поверхности эритроцитов человека, а также его растворимую форму в слюне 0 лиц - выделителей.

Продуктивность штамма. Титр МКА в культуральной жидкости составляет 1:256 - 1:512, в асцитной - 1:256х 103.

Стабильность продуктивных свойств со- 5 храняется в течение 15 пассажей.

Контроль контаминации. Бактерии, грибы и микоплазма не обнаружены. Тестирование на вирусы на проводилось.

Режим замораживания. Криозащитная 0 среда:

10% ДМСО, 40% любой сыворотки, ростовая среда.

Клетки выдерживают в течение суток при - 70°С. затем переносят в жидкий азот. 5 Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 60-65%.

Использование штамма Н - 89/8 иллюстрируется следующими примерами.

(Пример 1. Проводят оценку сероло- 0 гических свойств супернатанта, содержащего МКА, в отношении эритроцитов различных групп крови системы АВО, для которых характерно снижение содержания Н - антигена в ряду 0-В-А1-А1В. Двойные 5 разведения МКА на фосфатно - солевом буфере или 0,9%-ном NaCI в объеме 50 мкл вносят в ячейки 96 - луночной круглодонной платы и смешивают с равным объемом 2%- ной взвеси эритроцитов, полученных от од- 0 ного донора.

Через 30-60 мин инкубации при комнатной температуре определяют титр антител. За титр МКА принимают последнее разведение, дающее видимую реакцию агглюти- 5 нации. Результаты исследований представлены в табл.1.

Результаты, приведенные в таблице, свидетельствуют о том, что титр полученных МКА в реакции агглютинации с эритроцита- 0 ми группы А1В более чем в 100 раз ниже, чем с эритроцитами группы О. Это доказывает отличие антител Н - 89/8 от известных (Н - 86/44), а также их способность взаимодействовать с мембраносвязанной формой 5 Н - антигена, практически не дискриминируя эритроциты различных групп крови системы АВО,

П р и м е р 2. Образцы культуральной среды, содержащей МКА, разводят в 2 раза фосфатно-солевым буфером (рН 7,4) с добавлением 0,3% Твина-20. На нитроцеллю- лозную мембрану наносят разведенную в 100 раз трис-глициновым буфером слюну лиц - выделителей различных групп крови системы АВО. Кусочки мембраны помещают в лунки 96 - ячеечной плоскодонной платы и инкубируют в течение 1.5 ч при комнатной температуре на ротационном шейкере с образцами МКА в количестве 100 мл. Затем мембрану отмывают в 200 мкл фосфатно-со- левого буфера с 0,3% Твина-20 3 раза по 10 мин.

Далее мембрану инкубируют в течение 1,5 ч при комнатной температуре с разведенной в 500 раз антиглобулиновой сыво- роткой, меченной перексидазой. После . инкубации мембрану отмывают еще 3 раза по 10 мин 200 мкл фосфатно-солевого буфера с Твином-20.

Пероксидазную активность выявляют в растворе субстрата (4 - хлор - 1 - нафтола)

в течение 30 мин при комнатной температуре. Результаты исследований представлены в табл.2.

Результаты, представленные в табл.2, свидетельствуют о том, что активность полученных антител Н - 89/8 в иммунофермен- тном анализе максимальна с антигеном, содержащимся в слюне лиц - выделителей группы крови О.

Таким образом, данные антитела способны выявить Н-антиген в растворимой форме и могут быть использованы как ценный реагент в судебно-медицинской экспертизе вещественных доказательств.

Формула изобретения Штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus L. BCKK(N) № 461, используемый для получения моноклональных антител к мембраносвязанной и растворимой формам Н-антигена человека.

Использование: биотехнология, медико- биологические исследования и судебно-медицинская экспертиза. Сущность изобретения: получение штамма гибридных культивируемых клеток Mus musculus L, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) повышенной чувствительности по отношению к Н-антигену человека. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей (ДВА/2хВа lb/c)FI с клетками миеломы РЗ-ХбЗ-Ад.8.653.МКА относятся к Ig класса М. Их титр в культуральной жидкости, определяемый в Микропанельной реакции агг- лютинации с эритроцитами группы О, составляет 1:256-1:512, в асцитной - 1:256000. Полученные МКА способны взаимодействовать как с мембраносвязанной, так и растворимой формами Н-антигена человека. 2 табл. . ел с

Таблица 1

Таблица 2