СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУРЫ ЭНДОКРИННОЙ ТКАНИ Российский патент 1997 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к медицине, а точнее к цитологии.

Известен способ культивирования реагрегированных клеток мозга [1] Предварительно разобщенные клетки культивируют в постоянно перемешиваемой суспензии, помещенной в термостат с водяной баней. Многоэтапная обработка исходного материала, включающая центрифугирование, трепсинизацию, прохождение через магнитный размешиватель приводит к механической травме клеток, потере гормонально активных клеток, а также к увеличению риска их инфицирования. Кроме того, для получения необходимой концентрации клеток требуется большое количество исходного материала.

В качестве прототипа нами выбран способ получения клеток эндокринной части поджелудочной железы [2] Способ заключается в том, что измельченную поджелудочную железу инкубируют в смеси культуральной среды и глюкозы до образования монослоя. Основным недостатком способа является относительно небольшой выход гормонов.

Сущность изобретения заключается в том, что для культивирования клеток используют микрофрагменты неонатальной эндокринной ткани диаметром 0,5 0,8 мм при соотношении культуральной среды к объему флакона 1:3. Культивирование проводят при температуре 20 26^oC и скорости вращения роллера 60 70 об/мин, заменяя половину культуральной среды каждые 24 ч.

В результате увеличения выход гормонов в процессе культивирования. Например, выход гормона тестостерона в два раза больше, чем известными способами.

Способ осуществляется следующим образом. Семенники стерильно извлекают у однодневных (неонатальных) поросят, помещают во флаконы с раствором Хенкса или Версена с антибиотиками. Несколько раз промывают этим же раствором без антибиотиков. После извлечения тестикул работа проводится в ламинарном боксе. Острым путем удаляют белочную оболочку семенника. Семенник лезвием разрезают на микрофрагменты 0,5 0,8 мм. Полученные микрофрагменты трижды промывают средой 199. Стерильной пипеткой микрофрагменты вносят во флаконы с ростовой средой. Состав среды: 500 мл^мем, 50 мл¹⁰-%-ная сыворотка, 2,5 мл инсулин, 5 мл^л-глутамин, 10 мл 40%-ная глюкоза, 1200 мг/500 мл. среды HEPES.

Флаконы содержат по 3 мл ростовой среды. На один мл. среды приходится по 15 микрофрагментов. Флаконы помещают в роллерные установки, вращающиеся в горизонтальном положении со скоростью 60 70 об/мин. Такая скорость вращения флаконов обеспечивает оптимальный режим агрегации микрофрагментов. Роллерные установки помещены в термостат при температуре 20^oC. Смены ростовой среды на 50% проводили через каждые 24 ч. Уровень тестостерона в культуре определяют радиоизотопным методом.

Пример 1. Культивирование интерстициальных эндокриноцитов (клеток Лейдига). В качестве источников получения клеток. Лейдига используют семенники однодневных неонатальных поросят. Стерильно выделенные тестикулы промывали раствором Хенкса с антибиотиками, затем несколько раз без антибиотиков. Острым лезвием удаляли белочную оболочку семенника, разрезали на микрофрагменты 0,6 0,8 мм. Трижды промывали микрофрагменты средой 199, после чего стерильной пипеткой внесли во флаконы с ростовой средой по 3 мл. Флаконы поместили в роллерные установки в термостат при температуре 20^oC и скорости вращения 60 об/мин. Излучали морфологическую картину клеток Лейдига и уровень тестостерона на 2-е, 3-и, 5-е, 7-е сутки культивирования. Установлено, что на второй день культивирования клетки Лейдига в хорошем состоянии, отсутствуют явления некроза. Уровень тестостерона равен 4,6 нг/мл. Начиная с пятых суток культивирования начинают разрушаться межканальцевые связки, уровень тестостерона снижается (3,6 нг/мл среды).

Пример 2. Культивирование аденогипофиза. Для получения культуры клеток аденогипофиза были использованы неонатальные однодневные поросята в количестве 5 животных. Гипофиз стерильно извлекли, промыли раствором Хенкса с антибиотиками, затем без них. Затем аденогипофиз отделили от нейрогипофиза, лезвием разрезали на микрофрагменты 0,5 мл. Полученные микрофрагменты несколько раз промыли средой 199. Стерильной пипеткой внесли во флаконы с ростовой средой по 3 мл в каждом. Флаконы установили в роллерные установки в термостат при температуре 26^oC. Излучали морфологическое состояние клеток аденогипофиза в сроки 3, 5 дней культивирования. В эти же сроки определена концентрация ЛГ, ФСТ, ПрЛ. По мере культивирования клетки аденогипофиза сохраняют жизнеспособность и активно продуцируют гормоны. Установили, что концентрация гормонов ко вторым суткам культивирования достигает следующих цифр: ЛГ 0,9 JU/L, ФСГ 1,1 JU/L, ПрЛ 206 mJV/I, где ЛГ лютеинизирующий гормон, ФСГ фолликулостимулирующий гормон, ПрЛ пролактин. Клетки в хорошем состоянии, отсутствуют явления некроза. К третьим суткам морфологическая картина без отрицательных изменений. Уровень ЛГ 2,3 JU/L, ФСГ 1,3 JU/L ПрЛ 560 mJV/I. К пятым суткам отмечали следующие концентрации: ЛГ 0,6 JU/L, ФСГ 1,0 JU/L. Уровень содержания пролактина не изменился. Затем отмечалось постоянное снижение концентрации ЛГ, ФЦГ, а содержание пролактина не изменялось, максимальное содержание определяемых гормонов наблюдалось на третьи сутки культивирования эндокринной ткани. Отсюда оптимальными сроками забора культуральных клеток для трансплантации являются третьи сутки для ФСГ, ЛГ и пятые сутки для ПрЛ.

Пример 3. Культивирование интерстициальных эндокринноцитов (клеток Лейдига). Для получения клеток Лейдига используют тестикулы эмбриональных плодов человека 12 14 недельного внутриутробного развития (абортивный материал). Стерильно выделенные тестикулы промывали раствором Хенкса с антибиотиками, затем без антибиотиков. Измельчали на микрофрагменты 0,8 мм. Полученные микрофрагменты промывали средой 199 и стерильной пастеровской пипеткой вносили во флаконы с ростовой средой по 5 мл. Флаконы помещали в горизонтальном положении в роллерную установку при вращении роллера 70 об/мин. Культивирование проводилось в термостате при температуре 26^oC в течение 7 дней. Замену ростовой среды на 50% осуществляли каждые 24 ч культивирования. При культивировании в течение 7 дней осуществляется гистологический и гормональный контроль. Выяснилось, что со вторых суток культивирования клейки Лейдина располагаются большими группами, встречаются клетки в стадии митоза. Уровень тестостерона в питательно среде увеличивается к третьим суткам, затем к шестым суткам. Колебание концентрации тестостерона зависит от замены питательной среды на 50% каждые 24 ч.

Использование: медицина, цитология, биотехнология. Сущность изобретения: для получения культуры эндокринной ткани используют микрофрагменты ткани диаметром 0,5 - 0,8 мм. При этом соотношение культуральной среды к объему флакона составляет 1:3. Культивирование осуществляют при t^o 20 - 26^oC при скорости вращения роллера 60 - 70 об/мин, заменяя часть среды каждые 24 ч.

Способ получения культуры эндокринной ткани, включающий выделение неонатальной эндокринной ткани, ее измельчение и культивирование в термостате с последующей заменой культуральной среды, отличающийся тем, что для культивирования клеток используют микрофрагменты ткани диаметром 0,5 0,8 мм при соотношении культуральной среды к объему флакона 1 3, а культивирование проводят при 20 26^oС и скорости вращения роллера 60 70 об/мин, заменяя 1/2 культуральной среды каждые 24 ч.