СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕРВИЧНОЙ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК СЕМЕННИКА, ОБОГАЩЕННОЙ КЛЕТКАМИ ЛЕЙДИГА Российский патент 2003 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к цитологии.

Цель изобретения - получение первичной культуры клеток семенника, обогащенной клетками Лейдига с помощью дезагрегации ткани непротеолитическими ферментами.

Известен способ получения тканевой культуры семенника свиньи с использованием семенников взрослых животных ("Методика получения культуры клеток свиньи". Методические рекомендации. М., 1987). Однако в связи с тем, что в отличие от пре- и неонатальных семенников, в которых содержится до 50% клеток Лейдига, в семенниках взрослых животных их содержание не превышает 5-10% клеток Лейдига, данный способ низкоэффективен.

Известен способ получения культуры клеток Лейдига с использованием дезагрегирующей смеси, содержащей протеолитические ферменты (Дендеберов Е.С. "Культуральная аллотрансплантация неонатальных эндокриноцитов семенников". Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата мед. наук. М., 1993). Однако выход живых клеток при таком методе не превышает 50-60%.

Известен способ получения культуры эмбриональных клеток Лейдига, наиболее близкий к предложенному и взятый нами за прототип (Басмаджян М.Е., Геворкян В.И., Кирпатовский И.Д. и др. "Способ получения культуры эмбриональных клеток Лейдига", Авторское свидетельство SU 1317305). Способ осуществляли, диссоциируя ткань с помощью дезагрегирующей смеси, содержащей 0,2% раствора коллалитина с добавлением 23 мг раствора Версена на 100 мл смеси. Полученные клетки культивировали в ростовой среде, состоящей из равных объемов среды 199 и гидролизата лактальбумина с добавлением 20% сыворотки крупного рогатого скота. Однако в связи с этическими проблемами, связанными с использованием эмбриональных тканей человека, а также с опасностью заражения культур человеческими вирусами, в первую очередь вирусных гепатитов и СПИДа, данный способ имеет ограниченные возможности применения.

Задачей изобретения является разработка способа получения первичной культуры клеток семенника, обогащенной клетками Лейдига, обладающей высокой жизнеспособностью.

Способ осуществляли следующим образом.

Семенники извлекали у пре- или неонатальных плодов животных в стерильных условиях и помещали во флакон, содержащий 20 мл среды RPMI 1640 с добавлением антибиотиков (пенициллина, стрептомицина, канамицина и фунгизона). После пятиминутной отмывки семенники переносили в следующий флакон с аналогичным содержимым. Процедуру повторяли три раза.

Затем семенники переносили в стерильную чашку Петри, содержащую 10 мл среды RPMI 1640 с добавлением антибиотиков (пенициллина, стрептомицина, канамицина и фунгизона).

После удаления соединительной наружной оболочки и придатков содержимое белочной оболочки выдавливали пинцетом, расстригали на куски, размером 1-3 мм и с помощью пипетки переносили во флакон, содержащий 10 мл дезагрегирующей смеси, состоящей из среды DMEM с 0,1-2% раствора коллагеназы и 0,01-1% ДНК-азы. При понижении концентрации коллагеназы ниже 0,1% и концентрации ДНК-азы ниже 0,01% снижался выход клеток из ткани. При повышении концентрации коллагеназы выше 2% и ДНК-азы выше 1% понижалась жизнеспособность клеток. Флакон помещали в СО₂ инкубатор при температуре 37^oС и содержании СО₂, равном 6%. Культуру инкубировали 30-60 минут, мягко покачивая каждые 5 минут. Каждые 10 минут производили отбор выходящих клеток и перевод их в культуру. Из каждой порции отбирали аликвоту и проводили контроль количества и жизнеспособности клеток в камере Горяева с окраской трипановым синим или акридиновым желтым. Как только жизнеспособность клеток понижалась до 95-97%, процедуру прекращали. Суспензию клеток фильтровали через капроновый фильтр и отмывали от ферментов двукратным центрифугированием в стерильных полипропиленовых пробирках, содержащих 50 мл среды RPMI 1640 с добавлением антибиотиков (пенициллина, стрептомицина, канамицина и фунгизона) и 5% эмбриональной сыворотки теленка. Цетрифугирование проводили в рефрижераторной центрифуге при 800-900 об/мин, в течение 10 мин.

Осадок ресуспендировали в 5 мл среды DMEM, содержащей глютамин и 20% эмбриональной сыворотки теленка. Жизнеспособность и количество клеток подсчитывали в камере Горяева. Если жизнеспособность клеток была ниже 95%, то такие культуры не использовали. Клетки рассевали на пластиковые флаконы в концентрации 200-800 тыс. клеток на 1 мл и культивировали в СО₂ инкубаторе при температуре 37^oС и содержании СО₂, равном 6%. Наличие клеток Лейдига определяли окрашиванием культур судановыми красителями.

Пример. В качестве источника получения клеток Лейдига семенников использовали неонатальную ткань семенника однодневного поросенка. Дезагрегацию предварительно измельченной ткани проводили смесью, содержащей среду DMEM с 2% раствором коллагеназы и 0,1% ДНК-азы.

Рассев клеток проводили при посевной дозе 500 тыс. клеток на 1 мл в среде DMEM с глютамином, содержащей 20% эмбриональной телячьей сыворотки по 3,5 мл во флакон и культивировали при 37^oС в атмосфере 6% СО₂. Через 6-8 часов клетки прикреплялись к пластику, а через 10-16 часов распластывались и начинали расти.

Монослой образовывался через 36-48 часов. К этому времени он состоял в основном из клеток полигонального типа, богатых мелкозернистым материалом и вакуольными включениями, положительно окрашивающимися судановыми красителями.

Жизнеспособность клеток в культуре составляла 97-99%. Зависимость жизнеспособности и выхода клеток семенника от способа дезагрегации и культуральных сред представлена в таблице. Из таблицы видно, что применение в качестве дезагрегирующего агента коллагеназы в концентрации 0,1-2% и ДНК-азы в концентрации 0,01-0,1% позволяет добиться наибольшей жизнеспособности клеток, но наибольший выход при этом получали в варианте с 2% коллагеназы, 0,1% ДНК-азы, отмывкой в RPMI-1640 с 5% эмбриональной сыворотки теленка и культивировании в среде DMEM с 20% эмбриональной сыворотки теленка. Использование других концентраций дезагрегирующего агента, уменьшение концентрации сыворотки в отмывочной среде и использование для культивированния других сред, в том числе и среды, предложенной в прототипе, приводило к понижению жизнеспособности и/или к уменьшению выхода клеток.

Изобретение относится к цитологии. В качестве дезагрегирующей жидкости используют 0,1-2% раствор коллагеназы, содержащий 0,01-1% ДНК-азы. Культивирование клеток проводят в среде DMEM, содержащей 20% эмбриональной сыворотки теленка. Способ позволяет получить монослой первичных клеток семенника, обогащенный клетками Лейдига с жизнеспособностью 97-99%. 1 табл.

Способ получения первичной культуры клеток семенника, обогащенной клетками Лейдига, путем измельчения ткани семенника, ее дезагрегации в растворе, содержащем ферменты, диссоциирующие ткань, и культивирование в среде, содержащей сыворотку, отличающийся тем, что в качестве дезагрегирующей жидкости используют 0,1-2% раствор коллагеназы, содержащий 0,01-1% ДНК, отмывку от ферментов проводят в среде RPMI 1640, содержащей 5% эмбриональной сыворотки теленка, отбор клеток и перевод их в среду для культивирования проводят в течение всего времени дезагрегации, культивирование проводят в среде DMEM, содержащей 20% фетальной сыворотки теленка, что позволяет получить культуру клеток семенника, обогащенную клетками Лейдига с жизнеспособностью 97-99%.