Способ получения клеток эндокринной части поджелудочной железы эмбрионов Советский патент 1981 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к цитoJ:oгии. Известен способ получения клеток эндокринной части поджелудочной железы эмбрионов путем измельчения железы с последующей дезинтеграцией и выделением целевого продукта QlJ. Однако известный способ сложен и неэкономичен, так как при однократ ном переливании велики потери клеток Целью изобретения является упрощение способа. Эта цель достигается тем, что сог ласно способу получения клеток эндокринной части поджелудочной железы эмбрионов путем измельчения железы и последующей дезинтеграцией и выделением целевого продукта, измельченную поджелудочную железу заливают смесью среды 199 и 24-40%-ного раствора глюкозы, взятых в соотношении 9:1, полученную смесь инкубируют 2448 ч до образования монослоя, затем сливают среду, а к монослою добавляю свежую смесь среды 19У г и глюкозы, встряхивают и повторно инкубируют до образования монослоя. Способ осуществляют следующим . образом. Извлекают поджелудочную железу из спонтанно выкинутого плода челове1 а в возрасте внутриутробного развития 9-25 недель и помещают в сосуд с охлажденным до f С сбалансированным солевым раствором Эрла с антибиотиками для доставки в лабораторию. В лабораторном стерильном боксе в Стерильной посуде промывают орган для полного удаления крови, многократно наливая и сливая охлажденный раствор Эрла. Очищенный от крови орган помещают в чашку Петри с новой порцией охлажденного раствора Эрла с антибиотиками и отделяют паренхиму, удаляя волокнистую оболочку органа, и сосуды. Изолированную паренхиму поджелудочной железы переносят в другую чашку Петри с раствором Эрла с антибиотиками, прокывают трижды для полного удаления возможной флоры микроорганизмов, каждый раз сменив простерилизованную чашку Петри с новой порцией охлагкденного раствора Эрла с антибиотиками. Промытую в антибиотиках в растворе Эрла паренхиму поджелудочной железы Переносят в пенициллиновый флакон, разрезают ее глазными стерильными ножницами, превращая ее в кашицеобразную смесь, залиают 1-2 NWi питательной среды 199 и 2 5-40%-ного раствора глюкозы в соотношении 9:1. Сильным взмахом руки . смесь во флаконе 1встряхивают и помеают в термостат при 36,5-37, на 24-48 ч. Вся процедура промлвки изоированной паренхимы и ее размельчеНИН длится 10-15 мин.

Пример 1. При выделении клеток эндокринной части поджелудочной железы эмбриона 9-13-недельного срока внутриутробного развития дезагрегированную известным способом ткань поджелудочной железы из пенициллинового флакона, выдержанного 24 ч в термостате при Зб, в. питательной среде, состоящей из среды № 199 производства Института полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР и 25%-ной глюкозы в соотношении 9:1, в наклонном положении под углом 30 переливcUOT в другой флакон, а к первому флакону, где образовался моносло, добавляют свежую питательную среду в объеме 1 мл.

Пример 21. При вьзделении клеток эндокринной части плодов 1419-недельного срока внутриутробного развития дезагрегированную ткань из пенициллинового флакона через 30 ч после дезагрегации переливают полностью во флакон емкостью 50 мл и добавляют питательную среду в объеме 4 мл, а в пенициллиновый флакон вливают 1 МП питательной среды, оставляют в термостате при 37 С. Флакон объемом 50 мл оставляют в термостате при 37®С в горизонтальном положении для образования монослоя, последующее переливание осуществляют через 3-4 дня после образования монослоя.

Пример 3. При выделении клеток эндокринной части поджелудочной железы плода 20-25-недельного срока внутриутробного развития для переливания используют флакон емкостью 100 мл, а питательную среду добавляют к 1 мл из пенициллинового флакона с суспензией клеток с добавлением 9 МП питательной среды указанного состава. Последуюище переливания проводят после образования крнослоя, который образуется через 3-4 дня при при горизонтальном положении флакона.

Клетки Э.НДОКРИНЛОЙ части поджелудочной железы эмбриона человека, выделенные предложенным способом в виде суспензий и монослоя, не подвергаются химическим и механическим пов реждениям, благодаря чему полностью сохраняют свои нативные свойства,при этом эципарные клетки подвергаются элиминации, а клетки эндокринной части функционируют около 8-месячного срока. По предложен ному способу возможно селективно выделять клетки эндокринной части поджелудочной железы эмбрионов человека и благодаря селективности, основанной на нативных своствах клеток поджелудочной железы,выход вьаделяених клеток эндокринной части составляет 100%. Предложенный способ прост и доступен, так как Ъе требует применения сложной и дорогостоящей аппаратуры или приспособлений для измельчения и.дальнейшей обработки поджелудочной железы.

Формула изобретения

Способ получения клеток эндокринной части поджелудочной железы эмбрионов путем измельчения железы с последующей дезинтеграцией и выделением целевого продукта, отличающ и и с я тем, что, с целью упрощения способа, измельченную поджелудочную железу запивают смесью средал. 199 и 24-40%-ного раствора глюкозы,взя-i тых в соотношении 9:1, полученную смесь инкубируют 24-48 ч до образования монослоя, затем сливают среду, а к монослою добавляют свежую смесь среды 199 и глюкозы, встряхивают и повторно инкубируют до образования монослоя.

Источники информации,

,-принятые во внимание при экспертизе

1. Бабикова Р.А. с соавт. Клеточные культуры из поджелудочной железы плодов крупного рогатого скота, полученные с применением коллалитина. Бюллетень экспериментальной медицины, 1977, № 3, с. 350-353.