СПОСОБ НАПРАВЛЕННОГО БИОСИНТЕЗА ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 1997 года по МПК C12P7/48 C12N1/14 C12N1/16 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам производства лимонной кислоты.

Область применения лимонной кислоты с каждым годом расширяется, потребность в ней возрастает.

Лимонную кислоту в настоящее время получают путем выращивания микроорганизмов на углеводсодержащих субстратах (заявка Японии 55-15993, МКИ C 12 N 9/14), углеводородах нефти (Кулонен Н.И. Доброхотов Ю.Е. "Производство лимонной кислоты за рубежом". Труды ЛенНИИПП, Ленинград, 1985 г.) Недостатком этих способов явился низкий выход лимонной кислоты от поданного субстрата.

Наиболее близким по технической сущности является пат. США (N 4178211, МКИ C 12 D 1/04), в котором описывается процесс выращивания дрожжей Candida lipolitica АТСС 20510 на среде, содержащей смешанный источник углерода смесь углерода с уксусной кислотой или ее солью. Начальная концентрация уксусной кислоты или ее соли 1-5 мас. содержание углевода инициатора брожения -0,5-2,5 мас. Общее количество уксусной кислоты или ее соли 5-20 мас. вносят в течение всего периода брожения (1-15 сут). При этом получают лимонную кислоту и изолимонную кислоту в соотношении 4:1.

Недостатком изложенного способа является то, что в процессе выращивания синтезируется смесь изолимонной и лимонных кислот, при этом выход лимонной кислоты низок и составляет 50
Цель изобретения снизить расход сырья и материалов на производство лимонной кислоты и найти заменитель дефицитного источника углерода уксусной кислоты.

Технический результат предлагаемого способа заключается в увеличении выхода лимонной кислоты.

Поставленная цель достигается благодаря введению в зону ферментации в качестве источника углерода смесь этилового спирта и сахарозы в количестве от 1: 1 до 0,3:0,7, что позволяет увеличить выход лимонной кислоты на 25-28 по сравнению с прототипом за счет изменения в метаболизме микроорганизмов, вызывающего уменьшения величины цианидрезистентного дыхания и уменьшения доли углерода, идущего на конструктивный обмен. В исходную питательную смесь вносится сахароза не менее 5-20 от общего количества, подаваемого на ферментацию, что обеспечивает более интенсивное накопление биомассы в начале процесса.

Способ направленного биосинтеза лимонной кислоты заключается в том, что микроорганизмы, др. Candida lipolytica, грибы Aspergillus niger выращивают периодически на водной питательной среде, содержащей хлористый аммоний 1 г/л, однозамещенный фосфат калия 0,3 г/л, сернокислый магний, водный 0,2 г/л, сернокислый цинк, водный -0,05 г/л, сахарозу и этиловый спирт, взятых в соотношении от 1:1 до 0,3:0,7, суммарное количество углеродсодержащего субстрата составляло 45-60 л/г через 6 сут ферментации при аэрации, перемешивании, при оптимальной температуре для роста микроорганизмов и синтеза лимонной кислоты. В исходную питательную среду вносили 5-20 всего количества сахарозы, через сутки вносили смесь сахарозы и этилового спирта. Содержание лимонной кислоты определяли спектрофотометрическим методом. (Жаболовская И. А. и др. Хлебопекарная и кондитерская промышленность, 1968 г, N 8, с. 23-25).

В табл. 1 приведена зависимость выхода лимонной кислоты от соотношения концентрации сахарозы и этилового спирта. При отношении концентрации сахарозы к этиловому спирту 0,3:0,7 выход лимонной кислоты наибольший, составляет 98 при увеличении доли этилового спирта в смеси до 0,9 происходит снижение выхода лимонной кислоты и увеличение выхода биомассы, что экономически невыгодно. При увеличении доли сахарозы до 0,8 наблюдается снижение выхода лимонной кислоты от поданных субстратов.

В табл. 2 показано, как влияет количество сахарозы, вносимой в исходную питательную смесь, на выход лимонной кислоты. Наибольшее значение выхода (через 5 сут) после начала выращивания определялось в случае, если 10 всего количества вносимой сахарозы добавляли в питательную среду, при уменьшении количества вносимой сахарозы процесс идет дольше (7 сут), при увеличении первоначально вносимой дозы сахарозы до 250 происходило снижение выхода лимонной кислоты до 80 что связано с более длительной адаптацией культуры к росту на смешанном субстрате.

Пример 1. Выращивали грибы Aspergillus niger BKPM F-710 в ферментере 5 л, Т выращивания 32 ^oC на питательной среде, при перемешивании, аэрации. В исходную питательную смесь вносили 2 г/л сахарозы, хлористый аммоний 1 г/л, однозамещенный фосфат калия 0,3 г/л, сернокислый цинк, водный 0,05 г/л. Через сутки после начала выращивания в среду добавляли сахарозу и этиловый спирт в количестве 18 г/л и 20 г/л соответственно. Через 5 сут измеряли содержание лимонной кислоты и рассчитывали выход лимонной кислоты от поданных субстратов, которые составили 39,2 г/л, 98 соответственно.

Пример 2. Выращивали дрожжи Candida lipolytica BKMY-970 так же, как в примере 1, при этом выход лимонной кислоты составил 75
Пример 3. Выращивали грибы Aspergillus niger BKPM F-710 так же, как в примере 1, только вносили в исходную питательную смесь 5,4 г/л сахарозы, а через сутки добавляли 12 г/л этилового спирта и 22,6 г/л сахарозы, при этом выход составил 96 от поданного количества углеродсодержащего субстрата.

Пример 4 (по прототипу). Выращивали дрожжи Candida lipolytica Y-970 на среде, содержащей уксусную кислоту и сахарозу в количестве 5 по массе и 2,5 по массе соответственно, вначале вносили 1 по массе сахарозы, при этом выход составил 54
Таким образом, использование предлагаемого способа направленного биосинтеза лимонной кислоты позволяет повысить выход лимонной кислоты с 54 до 98

Использование: биотехнология, производство лимонной кислоты. Сущность: способ направленного биосинтеза лимонной кислоты. Способ заключается в периодическом выращивании микроорганизмов при аэрации, перемешивании на питательной среде, содержащей минеральные источники азота, фосфора, магния, марганца, калия, железа, два источника углерода: этиловый спирт и сахароза, взятых в соотношении от 1:1 до 0,3:0,7. В исходную питательную среду вносят 5-25 % всего количества сахарозы, через 5 сут выход лимонной кислоты от поданных субстратов составляет 98 %. Данный способ позволяет повысить выход лимонной кислоты, снизить себестоимость продукта. 2 табл.

Способ направленного биосинтеза лимонной кислоты путем выращивания микроорганизма продуцента лимонной кислоты на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора, калия, магния, марганца, при аэрации и перемешивании, отличающийся тем, что в качестве источника углерода используют смесь этилового спирта и сахарозы в соотношении 1 1 0,3 0,7, причем в исходную питательную среду перед культивированием вносят сахарозу в количестве 5 20% от общего ее количества, используемого в процессе культивирования.