УСТРОЙСТВО ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ И СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ Российский патент 1997 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно, к иммунологии, и может быть использовано при анализе плазмы крови на содержание специфических антител или антигенов.

Известно устройство для определения антигенов и специфических антител.

Недостатком данного устройства является сложность выполнения, низкая точность результатов анализа и невысокая чувствительность к определяемым компонентам.

Известно другое устройство для амперометрического иммуноанализа с использованием электрода Кларка,недостатком которого является громоздкость исполнения и использование дорогих реагентов.

Цель изобретения повышение производительности, точности и упрощение анализа.

На фиг. 1 изображено предлагаемое устройство: на фиг. 2 функциональная схема устройства.

Устройство содержит микропористую твердотельную кремниевую мембрану 3 с иммобилизированным антителом (антигеном), золотой электрод акцептор (анод) 4, катоды (источники е) 5, раствор Цитохрома C (red II) 7, раствор 4,4'-дипиридила 6, рабочую камеру 1 и камеру сравнения 2, источник напряжения 8, дифференциальный усилитель 9, аналого-цифровой преобразователь 10, электронно-вычислительную машину 11.

Устройство работает следующим образом.

1. Иммобилизируют антитела (антиген) на поверхности микропористой твердотельной кремниевой мембраны трех стадийной реакцией с Y - аминопропилтриэтоксисиланом (антиген или антитело иммобилизируют на мембране рабочей камеры и камеры сравнения).

2. Обрабатывают плазмой крови микропористую кремниевую мембрану рабочей камеры.

3. Погружают аноды рабочей камеры и камеры сравнения в раствор 4,4'-дипиридил.

4. Погружают катоды рабочей камеры и камеры сравнения в раствор цитохрома C(red II).

5. Подключают электроды к дифференциальному усилителю, к аналого-цифровому преобразователю и к ЭВМ.

При прохождении плазмы крови в рабочей камере устройства один из участков активной иммунно-химической пары связывается с заранее иммобилизированным на микропористой кремниевой мембране своим активным компонентом (т.е. антиген с антителом или антитело с антигеном) при этом диаметр пор мембраны уменьшается за счет закрытия их белковым полимером.

Следующим этапом в рабочую камеру и камеру сравнения вносится раствор Цитохрома C2+. При подаче постоянного напряжения на электроды Цитохром C2+ будет перемещаться от катода к аноду через мембрану и отдавать аноду электроны, при этом в цепи будет возникать электрический ток. Если антитело (антиген) нашел свой активный компонент антиген (антитело) в плазме, то за счет уменьшения диаметра пор мембраны рабочей камеры Цитохром C будет задерживаться им в порах. При этом ток в цепи будет падать. Падение же тока в камере сравнения, будет намного медленнее, чем в рабочей камере (но все же будет, так как Цитохром C будет накапливаться в порах мембраны и там).

Сравнение скорости падения силы тока в рабочей камере и камере сравнения позволяет:
1. Провести качественную оценку, т.е. если падение силы тока на обоих графиках отличается (в рабочей камере и камере сравнения), то в крови определен иммунологический компонент антиген (антитело).

2. Провести количественную оценку по скорости и характеру падения тока в рабочей камере. Для обработки данных с электродов ток через усилитель подается на аналого-цифровой преобразователь, а затем данные обрабатываются компьютером.

Для фиксации антител к поверхности мембраны применяется реакция белка (антитела или антигена) с силановыми связывающими агентами. Эти агенты представляют собой мономерные силаны, имеющие на одном конце органические функциональные группы, а на другом группы, реагирующие с неорганической поверхностью.

Типичным таким агентом является Y-аминопропил-триэтоксисилан (АПТС), который можно использовать для присоединения белка к кремнийсодержащей поверхности с помощью следующей трехстадийной процедуры. В кислых водных растворах эфирные группы АПТС гидролизуются с образованием гидроксилов, которые могут затем взаимодействовать с поверхностными силановыми группами. В результате получается поверхность с белковыми цепями, содержащими аминогруппу:

На второй стадии аминогруппы используют для получения активного промежуточного соединения альдегида по реакции с глутаровым альдегидом в нейтральной сред:

Последняя стадия заключается в реакции альдегидной группы с первичным амином белка с образованием аминной связи:

В качестве переносчика заряда через твердотельную кремниевую мембрану необходимо использовать полимер. Наиболее подходящим для этой цели полимером является естественный полимер редокс-белок (Цитохром C(red II). Акцептором электрона с Цитохрома C(red II) является золотой электрод, находящийся в растворе 4,4'-дипиридил:

Таким образом достигается быстрый перенос электрона от Цитохрома C к золотому электроду.

Предлагаемое изобретение позволяет повысить эффективность и точность анализа, упрощает его проведение.

Использование: изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано при анализе плазмы крови для определения антигенов и специфических антител. Сущность: устройство содержит рабочую камеру 1 и камеру сравнения 2, в каждой камере расположена микропористая твердотельная кремниевая мембрана 3 с иммобилизированными иммунными комплексами на мембране рабочей камеры и одним из компонентов иммунохимической пары на мембране камеры сравнения, которая помещается между 2-мя электродами, золотой электрод акцептор /анод/ 4, и катод /источник электродов/ 5, золотой электрод 4 погружают в раствор 4,4'-дипиридила 6, катоды 5 - в раствор цитохрома C(red)7, к электродам подключается источник напряжения 8 для обработки данных с электродов, ток через дифференциальный усилитель 9 передается на аналого-цифровой преобразователь 10, а затем сигналы с обеих камер обрабатываются компьютером II. 2 ил.

Устройство для определения антигенов и специфических антител, содержащее корпус и электроды, отличающееся тем, что оно снабжено рабочей камерой и камерой сравнения, в рабочей камере размещена твердотельная микропористая кремниевая мембрана, на поверхности которой образованы иммунные комплексы, камера сравнения снабжена мембраной, на поверхности которой фиксирован один компонент иммунохимической пары, противоположный определяемому, катоды обеих камер погружены в раствор цитохрома С (red II), золотые электроды акцепторы (аноды) погружены в раствор 4,4'-дипиридила, в цепи рабочей камеры и камеры сравнения установлен дифференциальный усилитель, соединенный с входом аналого-цифрового преобразователя, выход которого соединен с входом ЭВМ.