Изобретение относится к биохимии, а именно к препаратам, воздействующим на функциональную активность клеток и клеточных систем, в частности, в условиях неблагоприятных внешних воздействий, в частности в фазе роста в условиях нехватки питательных веществ, а также оказывающим на клетку оздоровительное или лечебно-профилактическое воздействие.
Среди биологически-активных веществ, обладающих воздействием на функционирование биоэнергетических систем клеток и нашедших практическое применение, известны такие препараты как цитохром C, убихинон, ионол.
В частности, убихинон (коэнзим Q) в дозе 200 мг/кг веса оказывает нормализующее воздействие на клетки в условиях некоторых гипоксий, являясь природным переносчиком электронов и занимая центральное место в цепи ферментов электронного транспорта, реагируя с тремя ферментными системами: НАД H2-оксидазой, сукцинат-CoO-редуктазой и системой цитохромов (Микробиология, 1979, 48, N 6, М. Г.И.Андреева "Влияние убихинонов и их аналогов на активность ферментов дыхательной цепи", с. 969-974). Однако узкая область использования, сложная технология получения (многостадийный химический синтез или экстракция из микроорганизмов с последующим концентрированием и очисткой), относительно невысокая эффективность затрудняют использование убихинона.
Ионол (2,6-ди-(трет-бутил-4-метилфенол) является антиоксидантом, это ингибитор синтеза RNK и свободно-радикальных процессов.
Препарат цитохром C выделен биологическим путем, структура не установлена. Препарат воздействует не процессы тканевого дыхания.
Применение названных препаратов ограничено относительно невысокими защитными возможностями при воздействии на клетку стрессовых воздействий, а также недостаточно нормализующими гомеостатическими свойствами при наличии в клетке негативных отклонений, вызванных указанными воздействиями, сложной технологией получения, высокой себестоимостью.
Известно применение для подобных целей препаратов, как правило экстрактов и настоек растительного происхождения настойки лимонника, женьшеня, левзеи, радиолы розовой, аралии, элеутерококка (Машковский М.Д. Лекарственные средства, М. Медицина, 1985, т. 1, с. 137-143).
Недостатком указанных соединений является то, что они обладают возбуждающим действием, имеют ограниченный спектр применения, достаточно дефицитны и относительно малоэффективны в связи с низкими концентрациями активного начала в получаемых растворах.
Среди препаратов, получаемых из растительного сырья, воздействующих на функциональную активность клеток, известен, в частности, и галактомин, выделяемый из клубней подснежника Воронова, амарилисов, а также содержащийся в листьях Ungernia Victoris. Препарат является ингибитором холинэстеразы, способствует нервно-мышечной проводимости, показан при двигательных и чувствительных нарушениях (Шарков П.Л. и др. Вестник рентгенологии и радиологии, 1974, N 2, с. 41-45. Авдусалатов А. Алкалоиды Pediculari, Ungernia, Galanthus, Авт.дисс.д.х.н. Ташкент, 1972).
Недостатком препарата является относительно высокая токсичность, узкий спектр действия.
Наиболее близкими по структуре к заявляемому является препарат полисахаридов полиглюкин, имеющий молекулярную массу 60000±10000, получаемый гидролизом декстрана из сахарозы с использованием L.mesenteroides. Препарат имеет общую формулу (C6H12O6)n, где n 300-400, и используется в качестве плазмозаменителя, в частности при шоке и кровопотере (Машковский М.Д. Лекарственные средства. М. 1985, т.2, с.100).
Недостатком указанных полисахаридов является недостаточное по эффективности воздействие и узкое по спектру воздействие на функциональную активность клеток.
В основу изобретения положена задача нахождения вещества, обладающего более эффективным воздействием, в первую очередь стимулирующим и регуляторным, на функционирование клеток эукариот и прокариот и сочетающего высокую эффективность, широкий спектр действия и минимум побочных отрицательных эффектов при введении в организм эффективных количеств препарата.
Эта задача решается использованием полисахарида общей формулы (C6H12O6)nKm, где n 3-12, m 0,2-5. Полисахарид является порошком, хорошо растворимым в воде и спирте, имеет характеристические пики в ультрафиолете в области 267-276 нм.
Данное соединение было получено из экстракта каллусной ткани Ungernia Victoria (растения третичного периода, эндемического для Гиссарской долины (Атлас ареалов и ресурсов лекарственных растений СССР, М. 1976, с.317)), однако в микроколичествах содержится в различных частях этого растения, а также некоторых других растений, например подорожнике, унгернии Северцева, амарилисе. Наряду с природным сырьем полисахарид получают культивированием с использованием биотехнологических методов ткани указанных растений.
Проведенные эксперименты, в частности, с помощью методов масс-спектроскопии показали, что полученный активный препарат содержал смесь полисахаридов различной мол. м. (540-2200), имеющих по данным количественного анализа содержание C, H и O, соответствующее моносахаридному звену при одновременном наличии в препарате в зависимости от источника получения полисахарида 1,3-10% K, что соответствует заявленному соотношению ингредиентов в формуле.
Выделение отдельных фрагментов полисахаридной смеси и их более детальный анализ не проводился из-за низкого содержания активного начала в получаемом экстракте, характеризуемом долями процента. Вместе с тем, как показали эксперименты, обработка клеточных систем водными или водно-спиртовыми растворами, содержащими 10-5-10-12 г/л, оказывает эффективное воздействие на их функционирование.
Изучение свойств препарата, получившего условное наименование "Влаирин", проводилось на клетках бактерий, человека, тканях и клеточных системах, а также живом организме в целом.
Препарат "Влаирин" выделялся как экстракцией (условия) биомассы Ungernia victoris (нативный препарат), так и экстракцией каллусной растительной ткани растений рода Ungernia (Ung. victoris, Ung. Sewerzawoe).
Для нативного препарата характеристичным являлась общая формула (C6H12O6)nKm при n 3-8, m 0,2-1,0, для препарата, полученного культивированием, как правило, n 3-12, m 2,0-5,0.
Сопоставление хроматограмм УФ-спектров, масс-спектров и данных электрофореза (фиг. 1-3) показало сходность набора компонентов смесей при различии соотношений входящих в них ингредиентов.
Сопоставление биологической активности фракций различного происхождения показало идентичность воздействия на клеточные системы в таких тестах, как радиозащитное действие, заживляющее воздействие на раневую поверхность, стимулирующее воздействие на рост клеток и привес молодняка птиц, что позволяет рассматривать препарат независимо от источника его происхождения как единое изобретение.
Механизм воздействия препарата "Влаирин" на клетку в настоящее время окончательно не установлен, однако полученные данные позволяют предположить, что воздействие на клетку обусловлено сочетанием репарационного воздействия на клеточные мембраны с ускорением осмотических процессов, включая K-Na обмен через стенку клетки вследствие появления дополнительной поляризации ее фрагментов. Одновременно можно предполагать, что вводимый полисахарид способен ингибировать радикальные и перекисные процессы в тканях и связывать некоторые токсические метаболиты.
Опыты, проведенные на животных, показали, что препарат характеризуется полной безвредностью, отсутствием мутагенного, канцерогенного, генотоксического действия.
В частности, LD50 при пероральном применении установить не удалось, т.к. введение препарата в дозах, превышающих эффективную в 20 тысяч раз, не оказало негативного действия на животных.
Генотоксичность препарата была изучена с помощью SOS-хромотеста (Quillardet P. Huisman O. Hofnung M. SOS chromotest, a direct assay of induction of an SOS function in Escherichia coli K-12 to measure genotoxicity. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1982, 79, p. 5971-5975. Quillardet P. Hofnung M. The SOS chromotest, a colorimetric bacterial assay for genotoxins; procedures. Mutat. Res. 1985 147, p.67-68. Labsystems Oy (1988). Bio SOS. Software User' s Guide.)
Тест включал в себя ДНК-повреждающую и SOS-индуцирующую активность, УФ-мутагенез, индукцию профагов и т.д.
Тест проводился на микробиологическом анализаторе "Bioscreen" (Labsystems) с использованием штамма E.coli PQ 37.
В результате проведенных экспериментов было показано, что препарат не является генотоксичным в концентрациях по крайней мере до 3,8 мг/мл, что более чем в 5000 раз превышает эффективную дозу.
Способ получения и области применения вещества иллюстрируются примерами.
Пример 1. Получение нативного препарата.
1 кг растения Унгерния Виктора, собранного в Гиссарской долине, промывали 4 л воды водопроводной, после чего ополаскивали 300 мл дистиллированной воды, после чего измельчали на части размером 3-5 мм и экстрагировали в течении 6 ч 1 л дистиллированной воды при комнатной температуре.
Полученный после экстракции нерастворимый осадок шрот отделяли, а экстракт поступал на стадию очистки от органических кислот и фенольных соединений.
На стадии очистки 0,8 л экстракта обрабатывали в сепараторе 0,5 л этилацетата при pH 2,0 и скорости перемешивания 1-3 об/мин 0,6 л органического слоя отделяли и отправляли на регенерацию этилацетата, а 0,5 л водного остатка смешивали с 0,5 л этанола.
Полученный раствор содержал 0,2 мг активного вещества и использовался для проведения испытаний.
Активное вещество, выделенное методом вакуумного упаривания нескольких порций концентрата, представляло собой смесь полисахаридов общей формулы (C6H12O6)3-8•K0,8
Ультрафиолетовый спектр, имеющий максимум при 267-276 нм и масс-спектроскопия полимера приведены на фиг. 1, 2.
Также обработка, проведенная с использованием в качестве источника сырья растение Унгерния Северцева, позволила получить 0,05 мг активного начала, содержащего 65% полисахарида общей формулы (C6H12O6)4-10•K0,2 имеющего аналогичный спектр.
Пример 2. 1 кг каллусной ткани Унгерния, здоровой и неповрежденной грибами или бактериями, промывался 5 объемами воды для удаления остатков культуральной среды, а затем обрабатывался по методике примера 1. Полученный экстракт содержал 0,05 мг полисахарида общей формулы (C6H12O6)3-12•K5.
Характеристический спектр и результаты масс-спектроскопии приведены на фиг. 3-4.
Пример 3. воздействие препарата "Влаирин" на функциональную активность клеток.
Эксперименты по воздействию препарата "Влаирин" проводились на системах перевиваемых клеток человека Hela и бласттрансформированных лимфоцитах по методике (Засухина Г. Д. и др. Вопросы вирусологии, 1981, N 1. с. 94-96; Hangerfort D.A. Stein. Techn. 1965, v. 40, p. 333-338).
Клетки Hela выращивали в стационарных условиях (Засухина) в течение 48-72 ч, после чего в среду вносили препарат в различных разведениях и считывали количество клеток, выросших в матрасах через 48 ч. Было установлено, что добавка 10-4 препарата повышает количество клеток на 10±5% 10-5 на 30±7% 10-7 на 3±3%
Дальнейшие эксперименты проводили с концентрацией препарата 10-5 на матрасах объемом 100 мл по 100 клеток на матрасе. Количество клеточных колоний определяли через 14 дней прокрашиванием красителем Гимза. В результате было установлено, что число колоний возросло с 66±5 до 87±7 (на 32%), причем число колоний, содержащих более 50 клеток увеличилось с 4 до 10.
Лимфоциты культивировали по обычной методике (Hangerfort). Через 1 ч после стимуляции клеток ФГА в среду вводили препарат в концентрации 10 мкл/л (разведение 10-5). На 66 часу роста число клеток по сравнению с контролем возросло на 25±7%
Полученные эксперименты показали, что применение препарата "Влаирин" стимулирует рост клеток человека, в частности, повышая их пролиферативную активность.
Пример 4. Влияние препарата "Влаирин" (культ.) на активность ферментов дыхательной цепи изучали на кроликах массой 1,5-3,5 кг по оценке состояния ферментов цепи передачи электронов мозговой ткани кроликов при гипоксии и в ранний восстановительный период. Гипоксическое состояние достигалось забором крови. На стадии трансфузии контрольной группы вводили кровь, обогащенную кислородом.
В табл. 1 представлены данные по отношению концентраций окисленной формы флавопротеинов к восстановительной форме NADH (K), парциальному давлению кислорода 
окислительно-восстановительному потенциалу крови (EMB) при введении водного раствора 10-5 г/мл названного препарата в дозе 35 мг/кг, а также по потреблению глюкозы (Сгл) и содержанию молочной кислоты (Смк) при введении 10 мг/кг указанного раствора.
Полученные данные показали, что введение препарата вызывает немедленный запуск ферментов дыхательной цепи.
Пример 5. Противовирусную активность препарата "Влаирин" и ремантадина исследовали на развивающихся куриных эмбрионах.
В аллантоисную полость одиннадцатидневных куриных эмбрионов вводили по 0,2 мл раствора нативного препарата в дистиллированной воде (доза препарата 10-6 мг/кг). Второй партии эмбрионов вводили препарат сравнения - ремантадин в оптимально рекомендуемой дозе 4 мг/кг. Объем вводимого препарата также 0,2 мл. Контрольной серии эмбрионов вводили равный объем воды. Затем эмбрионы инкубировали в термостате при 37oС в течение 2 ч, вводили вирус болезни Ньюкастла NDV штамм H в дозе 10 ИД/0,1 мл. Инфицированные эмбрионы дополнительно инкубировали в термостате 48 ч и определяли наличие в них вируса по реакции агглютинации. Результаты представлены в табл. 2.
Пример 6. Препарат "Влаирин" (культуральный) был испытан в опытах по откармливанию бройлеров на Братцевской птицефабрики Московской области.
Препарат задавался цыплятам с кормовой смесью с 5 по 360-ые сутки из расчета 0,085 г/кг веса в стаде из 500 голов молодняка кур породы Ломен Браун. На 35-е сутки вскармливания средний вес курицы составил 350±9 (контроль 335±11), петушка 430±12 (410±9).
Отмечалось, что количество птиц с поврежденным опереньем в опыте на 20% ниже, чем в контроле.
Падеж в опытном стаде отсутствовал, в контроле он составил 0,5%
Пример 7. Воздействие препарата "Влаирин" на функциональную деятельность организма.
а) Больная К. возраст 23 г. обратилась в поликлинику с жалобами на нерегулярные менструации с болевым синдромом, отсутствие беременности на протяжении двух лет супружества. Диагноз лечащего врача: дисфункция яичников. Лечение препаратом "Влаирин" (нативный) проводилось в течение двух месяцев перорально по 5 капель 3 раза в день. По прошествии курса лечения у пациентки наступила беременность, проходившая в последующем без существенных осложнений и завершившаяся нормальными родами.
б) Больная Н. 71 лет обратилась в июле 1993 г в поликлинику по поводу возрастной депрессии, общего упадка сил (невозможность передвигаться), расстройства сна, отсутствие аппетита. Лечение препаратом "Влаирин" перорально 3 раза в день по 4 капли проводилось в течение 1,5 мес. Уже через 2 недели лечения больная почувствовала значительное улучшение состояния. По окончании лечения у пациентки наблюдалось полное восстановление функций (нормализовался сон и аппетит, способность к передвижению). Она способна полностью обслуживать себя, включая обеспечение продуктами и уборку дома. До настоящего времени осложнения и жалобы отсутствуют.
в) Больной К. обратился с просьбой о помощи по поводу неоперабельного рака печени и желудка (диагноз поставлен после операции). Состояние больного: расстройство пищеварения, острые боли в области печени и всего живота. Прогноз отрицательный.
Лечение препаратом "Влаирин" проводится периодически повторяющимися курсами по 2 мес приема препарата по 8 капель экстракта 3 раза в день перорально, затем 1 мес перерыв, на протяжении 1,5 лет. В настоящее время пациент трудоспособен (режим труда общий), жалобы отсутствуют.
Пример 9. Воздействие препарата "Влаирин" (культуральный) на микроорганизмы на примере бактерий.
Эксперимент проводили на клетках микроорганизма рода Escherichia coli штамм М-17, выращенных на глюкозо-минеральной питательной среде следующего состава (г/л): KH2PO4 1,0; Na2HPO4•12H2O 1,0; NaCl 5,0; Na2CO3 2,0, MgSO4•7H2O 0,1; цитрат аммония 4,4; никотиновая кислота 0,005; глюкоза 0,3.
Было проведено изучение электрокинетического потенциала клеточной популяции до и после введения заявляемого препарата для живых и мертвых клеток названных микроорганизмов.
Результаты проведенного испытания показали, что при введении в культуру препарата в дозе 10-8 мг/л подвижность клеток микроорганизма Escherichia coli возрастает на 2.4 мв (по сравнению с контрольной клеточной популяцией, не испытывающей влияния препарата).
При дозе 10-5 мг/л подвижность клеток возрастает на 7,3 мв (по сравнению с контрольной популяцией).
Таким образом, введение препарата повышает форетическую подвижность живых клеток, что связано с изменением их биоэнергетических функций.
Изобретение относится к биохимии. Предложен полисахарид общей формулы (C6H12O6)3-12•K0,2-5, имеющий характеристический максимум в ультрафиолетовой области при 267-276 нм, способный воздействовать на функциональную активность клеток и клеточных структур. Полисахарид оказался перспективным в качестве лечебно-профилактического или стимулирующего препарата для применения в медицине, ветеринарии, прикладной биотехнологии. Полисахарид выделен из растения Унгерния Виктора, содержится в ряде других растений. Может быть получен водной экстракцией биомассы каллусной ткани при ее культивировании (каллус получается из растений рода Унгерния (Унгерния Виктора, Унгерния Северцева). 2 з.п.ф-лы, 4 ил.
(C6H1 2O6)nKm,
где n 3 12;
m 0,2 5,
имеющий характеристический максимум в ультрафиолетовой области при 267 - 276 нм, в качестве препарата, оказывающего воздействие на функциональную активность клеток и клеточных структур.
