СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ ПОВРЕЖДЕНИЯ КЛЕТОК ОРГАНИЗМА Российский патент 2000 года по МПК G01N33/48 C12N5/08 C12N15/00 

Изобретение относится к области биохимии, а именно к способам диагностики состояния клеточных структур.

Известны методы диагностики состояния клеток организма по наличию различных веществ во внеклеточной жидкости, по количеству эхиноцитов в крови и т. п. /1-3/. Их недостатками является узкая область применения, ограниченная либо конкретными видами клеток, что не позволяет получить общую оценку состояния организма в целом либо конкретными типами мутагенных воздействий.

Прототипом заявляемого способа является общий метод оценки воздействия на организм мутагенных факторов /4/, заключающийся в том, что культивируют лейкоциты больных с нарушениями систем репарации ДНК, в частности синдром Марфана, вводят защитные препараты и подвергают воздействию радиационных или химических мутагенных факторов, отмывают, а затем вводят питательную среду 199 с 10% сыворотки крупного рогатого скота, содержащую 5-бром-дезоксиуридин в конечной концентрации 5 мкг/мл. Клетки фиксируют через 96 часов после стимуляции ФГА, окрашивают, определяют частоту сестринских хромосомных обменов /СХО/ и репликационный индекс /РИ/ по соотношению метафаз I, II и III клеточных циклов, после чего оценку состояния организма проводят, исходя из коэффициента защиты K_з, определяемого по формуле

где P_м и P_к - частота СХО после обработки мутагеном и без обработки (контроль) - соответственно, а P_зи и P_з - соответственно частота СХО после последовательной обработки защитным агентом (интерфероном) и мутагенном, а также защитным агентом только.

Недостатком способа является неполная информация о состоянии организма.

Задачей, решаемой в рамках заявляемого способа, являлась модификация способа-прототипа таким образом, чтобы можно было судить о состоянии организма по величине K_з.

Указанная задача решалась культивированием клеток с использованием в качестве защитного агента препарата "Влаирин", использованием в качестве мутагенного фактора ионизирующего излучения в режиме, вызывающем радиоадаптивный ответ клеток - РАО, определением величины РАО и K_з в присутствии "Влаирина", а также степень повреждения клеток C_п по формуле C_п = K_з/РАО, диагностируя, что организм здоров или имеет малую степень повреждений при C_п = 1,0 - 2,0, среднюю степень повреждений при C_п>2,0 и тяжелую степень повреждений при отрицательном значении РАО и/или отсутствии роста клеток в присутствии препарата "Влаирин".

Исследования проводили при введении "Влаирина" в питательную среду в дозе не менее 1•10^-7 г/л по крайней мере за 12 часов до облучения.

Для получения РАО облучение осуществляют сначала малыми дозами ионизирующей радиации /0,1-10 РАД/, а затем большими дозами /2-4 Гр/ по методике, описанной в работе /5/.

При этом РАО определяют по формуле

где P_с - сумма повреждений при последовательном облучении малой и большой дозами гамма-лучей, P_б - сумма повреждений при облучении клеток большой дозой гамма-лучей; P_к - сумма повреждений в контроле без облучения. РАО - радиоадаптивный ответ, отражающий снижение структурных мутаций хромосом при облучении большими дозами радиации, в случае предварительного воздействия на клетку малых доз радиации.

В основе заявляемого изобретения лежит установленное авторами свойство препарата "Влаирин" блокировать в системе лимфоцитов крови бласттрансформацию клеток фитогемаглютинином при повреждении генома. Одновременно было установлено, что препарат при обратимых нарушениях мембран и/или клеточных стенок способен возвращать клеткам утраченные ими свойства, практически до уровня показателей здоровых клеток.

В настоящее время препарат "Влаирин" получают экстракцией каллусной ткани Унгернии Виктора.

Величины C_п при диагностике получали в результате статистической обработки показателей представительных групп больных при различных патологиях.

Анализ осуществляли следующим образом. В качестве источника малых доз радиации использовали бета-излучения H³-тимидина. (0.1 мкК/мл) в течение 20 часов. В качестве большой дозы использовалось гамма-облучение в дозе 2 Гр.

Лимфоциты крови культивировали in vitro по стандартной методике. Стимуляцию (бласттрансформацию) лимфоцитов проводили посредством фитогемагглютинина (ФГА). Клетки облучали гамма-квантами в дозе 2 Гр через 20 часов после начала культивирования и фиксировали через 52 часа. Обработку клеток препаратом "Влаирин" в концентрации 1•10^-6 проводили в течение 16 часов перед облучением. Анализировали частоту и спектр аберраций хромосом (АХ) перед облучением. Данная экспериментальная система дает возможность дифференцировать эффекты внутриклеточного облучения инкорпорированными радионуклидами от внешнего гамма-облучения. АХ хроматидного типа являются результатом облучения радионуклидами в S-фазе митотического цикла; АХ хромосомного типа - результат внешнего облучения радиоионизирующей радиацией в G-фазе, т.е. гамма-облучения через 20 часов после стимуляции клеток ФГА.

Опыты показали возможность применения препарата в дозах не ниже 1•10^-7 г/л при времени обработки не менее 12 часов, однако воздействие препарата имеет при граничных значениях большую погрешность.

Наиболее эффективным режимом является доза 1•10^-6 г/л в течение 16 часов. Использование больших количеств препарата в течение большего времени обработки экономически нецелесообразно.

Промышленная применимость способа иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Исследование выполнено на клетках крови детей как клинически здоровых доноров (6 человек), так и пациентов (10 человек), проживающих в течение 3-9 лет на территориях с уровнем радиационного загрязнения от 3.2 до 26.3 Ки/км в результате аварии на Чернобыльской АЭС (Брянская обл.), а также больных с различными поражениями.

Исследования проводились по описанной выше методике с различными количествами препарата. Результаты испытаний приведены в таблице 1.

Литература
1. А.с. СССР 1028716, кл. C 12 N 15/00.

2. Г. Г. Автандилов. Медицинская морфометрия в диагностике болезней, М. 1983, с. 6-120.

3. Авт.св. СССР 924102, кл. C 12 N 1/00.

4. Якубовская Е.Л. и др. Генетика, XXIV, N 11, 1988, с. 2050.

5. Olivieri G. et al., Science, 1984, v. 228, p. 594-597.

Способ определения степени повреждений клеток организма можно использовать в медицине и ветеринарии. Степень повреждения клеток организма определяется в присутствии препарата "Влаирин", обрабатывая лейкоциты периферической крови гамма-излучением. Измеряют частоту сестринских хромосомных обменов. Определяют коэффициент защиты К₃, величину радиоадаптивного ответа РАО и степень повреждения клеток C_п по формуле C_п=К₃/РАО. Диагностика степени повреждений клеток в присутствии препарата "Влаирин" по приведенной методике позволяет получить более полную информацию о состоянии организма. 2 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ определения степени повреждения клеток организма, включающий в себя культивирование лейкоцитов периферической крови испытуемого в присутствии защитного агента и без него, обработку лейкоцитов гамма-излучением, измерение частоты сестринских хромосомных обменов и определение коэффициента защиты, отличающийся тем, что в качестве защитного агента используют препарат "Влаирин", обработку лейкоцитов осуществляют дозами ионизирующей радиации, вызывающими радиоадаптивный ответ клеток, при этом дополнительно определяют величину радиоадаптивного ответа клеток испытуемого и определяют степень повреждения клеток С_п по формуле С_п = К_з/РАО, где К_з - коэфициент защиты при использовании препарата "Влаирин", РАО - радиоадаптивный ответ клетки, С_п - степень повреждения клеток, диагностируя, что организм практически здоров или имеет малую степень повреждений при С_п = 1,0 - 2,0, наличие средней степени повреждения при С_п более 2,0 и наличие тяжелой степени повреждений при отрицательных значениях радиоадаптивного ответа или отсутствии роста клеток в присутствии препарата "Влаирин". 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что "Влаирин" вводят в среду в концентрации 1 • 10^-5 - 1 • 10^-7 мг/мл, по крайней мере, за 12 ч до облучения. 3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что облучение проводят последовательно дозами радиации 0,1 - 10 рад и 2 - 4 Гр.