(:.4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-лизин А
Изобретение относится к технике получения L-лизина путем культивиров ния микроорганизмов, используемого для приготовления пищевых продуктов и повышения их питательных свойств. Наиболее близким к изобретению является известный способ получения L-лизина путем культивирования проду цирующих его микроорганизмов рода Corynebacter1 urn или Brevibacteriurn на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, необходимые минеральные соли в присутстви антибиотиков или поверхностно-акти ных веществ, или антиокислителей с последующим выделением целевого про дукта l . Однако по известному способу выход L-лизина недостаточно высркий. Для повышения выхода Ьлизина в предлагаемом способе из рода Согупе bacterium или Brev1bacteriurn испиль зуют штаммы Corynebacterium glutamicum FERMP-1987, FERMP-1613,FERMP-ISB или Brevibacteriurn lactofermentum FERMP-1944, FERMP-1711, FERMP-1857, FERMP-1572, FERHP-1574, FERMP-1575, FERMP-1841. Культивирование ведут на среде,содержащей в к честве источника углерода углеводы ИJlи спирты,или органические кислоты, в присутствии антибиотиков, выбранных из группы хлорамфеникол, эритромицин, диоксистрептомицин, тетрациклин, или поверхностно-активных веществ или антиокислителей в количествах, соответственно равных 3,525 мг/мл, 0,05-2% или 0,05-1,0 мг/мл. спосоо осуществляют следующим образом. Продуцирующие L-лизин микроорганизмы из рода Corynebactcг 1 urn или Вгevibacterium культивируют на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и необходимые минеральные соли в присутствии антибиотиков, или поверхностно-активных веществ, или антиокислителей, в количествах, соответственно равных 3,5-25 мг/мл, 0,05-2% и 0,051,0 мг/мл, Из рода Corynebacterium или Brevibacterium используют штаммы Corynebacteriunr gjtamicum FERHP-1987 FERMP-1613, FERHP-1982 или Brevibacterium lact-ofermentum FERMP-1944, FERHP-1711, FERMP-1857, FERMP-1572, FERMP-1S74, FRRMP-1575, FErvMP-1841. В качестве источнижов углерода в среде культивирования используют
углеводы или спирты , или органические кислоты.
Из углеводов используют глюкозу, фруктозу, мальтозу, сахарозу, крахмал, гидролизованный крахмал и мелассу. Из органических кислот используют уксусную, пропионовую, бензойную или фумаровую кислоты, а из спиртов - метанол, пропанол или этанол.
Среда может содержать несколько источников углерода. Некоторые мутанты ассимилируют углеводороды в качестве основного или второстепенного источника углерода.
В качестве источников азота применяют соли аммония, нитраты, карбг1миды, аминокислоты и жидкости, получаемые после вымачивания кукурузы, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, рыбную муку, пептон, бульон, продукты гидролиза казеина и их смеси, а та,кже аммиак.
Необходимые неорганические ионы отмачивают сульфатом магния, фосфатом магния, первичным кислым фосфорнокислым ксшием, сульфатом железа, хлоридом марганца, хлоридом кальция, хлоридом натрия и т.п.
Антибиотики выбирают из группы хлорамфеникол, казугамицин, тетрациклин, экситетрациклим, эритромицин диоксистрептомицин, митомицин С, антиномицин D, циклозерин, соединение группы пенициллина, цефалоспорина, полимиксин и азосерин.
Из поверхностно-активных веществ в среду вводят сульфат высшего спирта; алкилбензосульфонат; алкилфосфат и диалкил-сульфосукцинат; катионные вещества, например соли алкиламина и четвертичные аммониевые соли; неионные вещества, например алкильный простой эфир полиокталкилена, моноалкильный простой эфир полиоктэтленсорбитана и сорбитан монолаурат; амфотерные вещества, как имидазолин и бетаин.
Из антиокислителей в среду вводят 4,4-диокси-З 3-диметилдифенил; 2,6-ди-3-бутилфенол, катехол, бутилкатехол, протокатеховую кислоту, « -токоферол, пирогаллал, галловую кислоту, сложный эфир галловой кислоты, нафтол;фенольнь1е соединения, наприме амфинофенол, амины, например нафтнламин, дифениламин, ди-2-бутил-И-фенилендиамин, б-этокси-2,3,4-триметил-1,2-дигидрохинолин, семикарбазид, фенотиазин и тетрафенилгидразин; соединение, содержащее серу, например тио-дипропионопая и тио-дигликолевая кислота.
Водородный показатель рН ферментационной среды контролируют и поддерживают на уровне, необходимом для оптимального получения L-лизина, преимущественно в пределах от 5,0 до 9,0, добавлением карбамида, аммиака.
углекислого кальция, органических и неорганических кислот в процессе ферментации.
Ферментацию осуществляют при температуре 24-37°С, значение которой зависит от культивируемого микроорганизма, при аэробных условиях в течение 2-7 дней.
L-лизин извлекают из жидкой среды (бульона) одним из известных способов, например путем адсорбции на О подходящих ионообменных смолах, с последукицим отмыванием, удалением клеточного материала и концентрированием фильтрата, содержащего L-лизин.
5 L-лизин идентифицируют по его мингидринной реакции на бумажной хроматограмме, по значению показателя Rf на бумажной хроматограмме, по данным электрофореза, качественного
0 микробиологического определения и по реакцик с декарбоксилизой лизина, а также по результатам, получаемым при применении тождественных образцов. Количество L-лизина, выработанного в составе булЁонной культуры, определяют калориметрическим методом, основанным на кислотной медной, нингидринной реакции.
Получаемые результаты относятся
к солянокислому производству.
Пример 1. Готовят питательную сред для культивирования следующего состава,%; глюкоза 10; сернок слый аммоний 4,5; первичный кислый
фосфорнокислый калий 0,1; семиводный сернокислый магний 0,04; катион двухвалентного железа 2 млн ;катион двухвалентного марганца 2 млн ;биотин 50 мг/л; хлористоводородная соль тиамина 200 мг/л; продукт гидролиза
соевого протеина (общее содержание азота 7%) 1, углекислый кальций (стерилизован отдельно) 5. Устанавливают рН 8,0 и делят на порции по 20 мл. К каждой порции добавляют
хлорамфеникол или Мирамол 2МСА (торговое наименование катионного поверхностно-активного вещества), в указанных ниже количествах добавляют в колбы по 500 мл, перемешивают
встряхиванием и стерилизуют.
Отмеренные порции инокулируют, соответственно Brevibacterium lactofermentum - 1944 (штамм, устойчивый к действию ЛЕС, полученный искусственным путем из BreviЬасteruim
lactofermentum ATCC 13869 (и Corynebacterium glutamicum FERMP-1987 (штамм, устойчивый к действию АБС полученный искусственным путем из Micrococcus glutamicus ATCC 13032),
которые предварительно культивируют на косых желатиновых средах на бульоне, содержащем глюкозу. Культивирование проводят при 31°С и встряхивании.
Затем отмеренные порции делят на две группы порций.
К одной группе порций добавляют хлорамфекол сразу или через 15 ч, считая от момента инокулирования, i
Примечание. Рост - после 26-кратного разбавления, ПС сравнению с первоначальным объемом определяют оптическую плотность при 562 тм.
Из ферментационных бульонов в которых культивируют оба штамма в среде, к которой не добавляют антибиотики, отбирают более 300 колоний для каждого и исследуют на способность вырабатывания L-лизина. При этом устанавливают, что все они обладают устойчивостью к ЛЕС, что служит доказательством пригодности штамма для выработки L-лизина. Это
зина проводят ферментацию способом, описанным в примере 1, но добавляют О,5 мг/мп эритромицина в начале инокулирования и 3 мг/мл эритромициколичествах, указанных в табл. 1, Процесс ферментации проводят 72 ч,о
т а б л и ц а 1
свидетельствует также об отсутствии явления, обратной мутации для применения мутайного штамма даже после 72 ч культивирования.
К другой группе порций добавляют Миранол 2МСА (торговое наименование) сразу или через 7 ч после инокулирования в количествах, приведенных в табл. 2.
Т а б л и ц а 2
инокулирования.
Культивируют 82 ч,при этом количество L-лизина, накопившегося в бульоне, приведено в табл. 3. Т а Ь л и да 3
Пример 3. Ферментацию проводят способом описанным в примере 1, но добавляют продукт TBeH-ZO (торговое наименование П р И м е р 4. Ферментацию проводят, как описано в примере 1, применяя штамгал BrevJbacteriurn lactofermentum FERMP-1711 (обладает устойчивостью к АЕС и потребностью в аланине) Corynebacterium glutamicum FERMP-1613 (обладает устойчивостью к АЕС и потребностью в серине), Corynebacterium glutamicum FERMP-198 (обладает устойчивостью к АЕС и потребностью в пролине), Brevibacterium lactofermentum FERMP-1857 (обла
Диоксистрептомицин,
МГ/МЛ :
вначале -0,5 0,97 4,7
через 24 ч - 4
без добавления 1,05 4,2
Тетрациклин,мг/мл:
вначале -1,0 1,0 2,8 P
через 24 ч - 7,0
без добавления 1,11 2,5
Продолжение таблицы 3
полиоксиалкиленовых -производных сорбитан-монолаурата). Культивируют 72 ч. Количество накопившегося в бульоне L-лизина приведено в табл. 4.
Т а б Л и ц а 4 дает устойчивостью к АЕС и потребностью в аланине и лейцине), Brevibacterium 1actofermentum FERMP-1574 (обладает устойчивостью к АЕС и потребностью в никотиновой кислоте или никотинамиде) и Brevibacterium lactofermentum FERMP-1575 (обладает устойчивостью к АЕС и потребностью в гипоксантине). Культивируют 72 ч. Количество L-лизина, накопившегося в бульоне, приведено в табл.5. Таблица 5
Пеницилин,ед/мл:
вначале - 1,0 ед/мл 0,93 3,3
через 24ч5,0 ед/мл
без добавления 1,02 3,0
Пример 5. Ферментацию проводят , как описано в примере 1, используя штаммы Corynebacterium glutamicum FERMP-1613; Corynebacterium glutamicum FERMP-1982; Micrococcus glutamictis ATCC 13286 (обладает потребностью в гомоозерине); Brevibacterium 1 асtofermenturn. FERMP-1572 (обладает устойчивостью к ЛЕС и потребностью в серине совместно с лейци ном); Brevibacterium 1actofermentum. FERMP-1574, Brev i bacter iutn lactoferglutamicum FERMP-1982Micrococcus gluta micus ATCC 13286 Brevibacterium lactofermentum FERMP-1572 Brevibactorium 1actofermentum FERMP-1574
75905610
Продолжение таблицы 5
4
mentum FERMP-1575 и BrevibacterIum lactofermentum FERMP-1841.
Добавляют также питательные вещества, поверхностно-активные вещества, соответственно, после 16 ч культивирования.
Культивируют 72 ч. Количество на,копившегося в бульоне L-лизина приведено в табл, 6.
Таблица 6 без добавления3,0 Рипомин LH:4,3 0,1% без добавления3,8 Ованол 516:0,05%5,1 без добавления4,6 Рипонокс NCK: :0,13,6 без добавления 3,1
Примечание. Рипон LE110 - этаноламиновая соль алкилбензолсульфокислоты; Рипонол LL103 - лаурия сульфат, Рипомин 1Н - амфотерные поверхностно-активные вещества типа имидазолина; Рипонокс NCK - простой алкильный фенольный эфир полиоксиэтйлена/ Ованол 516 - агчфотерное поверхностно-активное вещество типа бетаина; Катионал НТВ - бензолконийхлорид; .Ниссаннонион LT221 - неионное поверхностноактивное вещество.
Примере. Процесс получения L-лиэина проводят, как описано в примере 1, но в качестве микроорганизмов используюФ штаммы Brevlbacterlum lactofermentum FERMP-1944, FERMP-17ia, FERHP-1572, FERMP-1574, FER«P-15T5, FERMP-1841, Corynebacterlum glutainJcum FERMP-1987,FERMP-1613,
Brevlbacterium lactofermentum FERHP-1944
Brevlbacterium
lactofermentumFERHP-1711
Гипоксантин-10
OL-метионин-150
Продолжение таблищл 6
FERMP-1982 И Micrococcus glutamicus ATCC-13286.
В среду добавляют питательные вещества, необходимые в некоторых случаях, и антиоксиданты.
Культивируют 72 ч.
Количество накопленного L-лизина приведено в табл. 7.
Т а б
лица
Галловая кислота: вначЕше -0,5 без добавления
L-аспаратновая кислота и лаурилгаллат:
через 12 ч - 0,05 без добавления
Тио-дигликоль:
через 12 ч - 0,05
без добавления
L-токоферол:
через 12 ч - 0,1
без добавления
Бутилоксиакизол
(ВИД):
через 12 ч - 0,05
без добавления
Бутилкатехол:
через 12 ч - 0,1
без добавления
Протокатеховая
кислота:
вначале
без добавления
Corynebacterium g 1 utami cum FERMP-1613
Brev i bac te r i urn 1actofermenturn FERMP-1982
Приме р7. Готовят питательную среду для культивирования при рН 8,0, содержащую компоненты, %: свеко ;ьная меласса (в пересчете на глюкозу) 10; сернокислый аммоний 4,5/ первичный кислый фосфорнокислый калий 0,1: MgS04-7H2 0 0,04; продукт гидролиза осевого протеина (общее содержание азота - 7%) 1,5;углекислый кальций 5,0;катионы двухвалетного железа и двухвалетного марганца по 2 млн ; биотин 50 мг/л и хлористоводородная соль тиамина 200 мг/л.Среду делят на отдельные порции по 20 мл и каждую
Контроль (гтсутствие)
Примере. Вгруibacteriurn lactofermentum FERHP-1711 культивируют, как в примере 7, но применяют содержащую 15% свекольной мелассы (в пересчете.на глюкозу), а 0,1% Миранола 2МСА добавляют через 26 ч после йнокулирования.
Культивируют 90 ч, при этом наколение в бульоне L-лизина равно 5,8 г/дл. При культивировании без Миранола 2МСА накопление L-лизина равно 5,2 г/дл.
Продолжение табл. 7
Бутилокситолуол:
через 12 ч - 0,05
без добавления
ВНА и тио-дигликолевая кислота:
через 12 ч - 0,02
и 0,1 соответственно
без добавления
помещгиот в 500 мл колбу, перемешивают встряхиванием и стерилизуют.
Затем отмеренные порции инокулируют штаммом Brevibacterium Jactofermentum FERHP-1711, культивированную ранее на косых желатиновых средах на бульоне, содержащем глюкозу.
Культивируют при 31°С 72 ч при встряхивании и добавлении к средэ хлорамфеникола, эритромицина, Миранола 2МСА и/или Твена 20.
Количество накопленного L-лизина приведено в табл. 8.
Таблица
3,5
Пример 9. Corynebacterium glutamicum FERHP-1982 культивируют, как в примере 7, но применяют патоку тростниково-CcixapHoro производства вместо свекольной мелассы и к среде добавляют тетрациклин, Ниссаннонион LT221 или галловую кгслоту. Культивируют 72 ч.
Количество накопленного L-лизина в бульоне приведено в табл. 9.
Галловая кислота 0,5%
Контроль (отсутствие)
Формула изобретения
Способ получения L-лизина путем культивирования продуцирующих его микроорганизмов рода Corynebacteriurn или Brevibacteriurn на питательной среде, содержащей источники углерода азота, необходимые минеральные соли в присутствии антибиотиков, или поверхностно-активных веществ, или антиокислителей, с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода лизина, из рода CorynebacterIum или Brev bacteriurn используют штаммы Corynebacterlum g4utamicum FERMP- 1987, FERMP-1613, FERMP-1982 или Brevibacterium lactoТаблица
19
3,5 3,1
fermentum FERMP-1944, FERMP-1711, FERMP-1857,, FERMP-1572, FERMP-1574,
0 FERMP-1575, FERMP-1841, при этом культивирование ведут на среде, содержащей в качестве источника углерода углеводы или спирты, или органические кислоты, в присутствии антибиоc тиков,выбранных из группы: хлорамфеникол, эритромицин, диоксистрептомицин, тетрациклин, или поверхностноактивных веществ, или антиокислителей в количествах, соответственно равных 3,5-25 мг/мл, 0,05-2% и 0,051,0 мг/мл.
Источники информации, принятые во внимание при экспертизе
jl. Патеит Франции 2050080, кл. С 12 D 13/00, опублик. 1971.
