СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ИНДОЛА В РАСТИТЕЛЬНОМ МАТЕРИАЛЕ Российский патент 1997 года по МПК G01N30/06 

Изобретение относится к области парфюмерной и косметической промышленности, также может быть рекомендовано для использования в области биохимической и микробиологической биотехнологии. Изобретение предназначается для диагностики богатых индолом источников сырья и скрининга растительного материала для оценки содержания индола, являющегося важным пахучим компонентом ароматических выделений и масел из цветков и пыльцы, а также служащего предшественником для биосинтеза индольных алкалоидов и фитогормона индолилуксусной кислоты.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому способу является способ выделения эндогенного индола из цветочных масел [1] так как по этому способу индол выделяют из растительных объектов, цветов, масла которых могут содержать 0,1-2% индола. Недостатком этого способа является трудность выращивания и обработки нескольких сотен килограммов цветов, необходимых для получения цветочного масла. Для количественного определения содержания индола по этому способу используют малочувствительную и неспецифичную реакцию с реактивом Эрлиха, поскольку все производные индола образуют сине-фиолетовые окрашенные комплексы с реактивом Эрлиха.

Известен способ определения индола, основанный на его экстракции толуолом из водных растворов или из реакционных смесей для испытания активности ферментов, субстратом или продуктом реакции которых является индол, и измерения экстинкции после реакции аликвоты толуольного экстракта с реактивом Эрлиха [2] Недостатком этого способа является низкая специфичность метода определения индола и его малая чувствительность при определении с реактивом Эрлиха, так как для проведения колориметрической реакции по этому методу требуются 50-100 мкг индола в образце, что значительно превышает его содержание в отдельных частях или органах растения.

Известен другой способ определения индола, основанный также на его экстракции толуолом из реакционных смесей с добавленным извне индолом для испытания ферментной активности, согласно которому присутствие индола в образце оценивается визуально по Rf на бумажной хроматограмме после окрашивания реактивом Эрлиха или Сальковского [3] Недостатком этого метода является низкая чувствительность и сложность количественного определения по этому способу, так как при высушивании хроматограмм и элюции пятен потери количества индола могут составить 85-90% вследствие его летучести.

В известных способах [1,2,3] не рассматриваются трудности выделения индола из растительного материала, поскольку традиционные методы извлечения индольных продуктов, включающие фиксацию растительного материала спиртом или ацетоном, экстракцию и упаривание органического растворителя под вакуумом, не применимы к определению индола вследствие его летучести. Использование холодной водной экстракции, связанной с измельчением растительного материала, для выделения индола также неприемлемо вследствие присутствия в растительных клетках ферментов оксидазы индола [3] и оксигеназы индола [4] которые быстро разрушают как эндогенный индол, так и экзогенный индол после размельчения растительной ткани. С другой стороны вледствие своей высокой реакционной способности индол легко превращается в другие продукты, поэтому методы его количественного определения должны осуществляться в течение минимально короткого срока. Упомянутые трудности удается преодолеть в заявляемом способе, по которому растительный материал одновременно фиксируют горячим водяным паром и нагревают его до кипения с целью возгонки индола и последующей его конденсации в водном растворе. Вся процедура от момента помещения растительного материала в колбу до получения результатов количественного определения занимает не более двух часов.

Техническим результатом заявляемого способа является упрощение выделение индола. Это достигается тем, что в предлагаемом способе для определения содержания индола используют возгонку индола горячим водяным паром из растительного материала, погруженного в небольшой объем бидистиллированной воды. При прохождении пара с индолом через холодильник происходит конденсация пара и накопление летучего индола в водном растворе. Образующийся конденсат пропускают через колонку с силасорбом C₁₈ для концентрации индола. С помощью ацетонитрила индол омывают с колонки C₁₈ и этот ацетонитрильный раствор используют для газожидкостной хроматографии или газожидкостной хроматографии в сочетании с масс -спектрометрией. В качестве внутреннего стандарта для количественного определения методами газожидкостной хроматографии и масс-спектрометрии вносят перед паровой возгонкой в растительный материал определенное количество ¹⁵N-индола.

Перечень рисунков хроматограмм и масс-спектров, подтверждающих сущность заявляемого способа: фиг. 1 масс-спектр и хроматограмма стандартов ¹⁴N-индола и ¹⁵N-индола после паровой возгонки из бидистиллированной воды и концентрации на колонке C₁₈; фиг. 2 - масс-спектр стандартов ¹⁴N-индола (25 мкг) и ¹⁵N-индола (23 мкг), полученных после возгонки иp бидистиллированной воды и концентрации на колонке C₁₈. Молекулярный ион ¹⁴N-индола с m/e 117, молекулярный ион ¹⁵N-индола с m/e 118; фиг. 3 масс-спектр и хроматограмма эндогенного ¹⁴N-индола и стандарта ¹⁵N-индола после паровой возгонки и концентрации на колонке C₁₈ конденсата из эндосперма кукурузы (1 месяц после опыления), в который был внесен внутренний стандарт ¹⁵N-индол; фиг. 4 масс-спектр молекулярных ионов с m/e 117 (эндогенный ¹⁴N-индол) и с m/e 118(стандарт ¹⁵N-индол) после паровой возгонки и концентрации на колонке C₁₈ конденсата из эндоcперма кукурузы (1 месяц после опыления), в который был внесен внутренний стандарт ¹⁵N-индол.

Возможность осуществления заявляемого способа подтверждают следующие примеры.

Пример 1. В круглодонную колбу объемом 1 л наливали 100 мл бидистиллированной воды, вносили смесь, состоящую из 25 мкг ¹⁴N-индола и 23 мкг ¹⁵N-индола в 1 мл 50% изопропанола. В горло колбы вставляли стеклянную насадку с отводной трубкой, соединенной со стеклянным холодильником. В верхнее отверстие стеклянной насадки вставляли резиновую пробку с проходящей насквозь стеклянной трубкой, верхний конец которой был соединен с источником пара, а нижний конец достигал дна колбы, причем расстояние между нижним концом и дном колбы сохранялось примерно в 0,5 см. Пар, проходя по стеклянной трубке со скоростью 50-100 мл в мин, нагревал толщу жидкости до кипения. Образующиеся пары возгонялись по боковой отводной трубке в холодильник, в котором конденсировались, а образующиеся капли конденсата отекали в мерный цилиндр. Конденсат в объеме 15 мл пропускали через колонку (10 мм диаметром и высотой в 10 мм), заполненную силасорбом C₁₈ (Chemapol, ЧССР, размер частиц 5 микрон), предварительно активированную безводным ацетонитрилом. Затем колонку промывали 1 мл бидистиллированной воды и высушивали для удаления следов влаги с помощью полосок фильтровальной бумаги. Затем колонку промывали 0,75 мл безводного ацетонитрила и этот раствор (1-2 мкл) использовали для закалывания в инжектор газового хроматографа с пламенно-ионизационным детектором. Параметры хроматографии выдерживались следующие: капиллярная колонка DB-17, 15 м длиной, диаметром 0,25 мм, изготовленная из расплавленного силикагеля, температура инжектора 130^oC, начальная температура печи 100^oC, выдерживалась 1 мин, затем происходил подъем со скоростью 30^oC в мин до 190^oC. При этих условиях и скорости потока газа -носителя гелия 2 мл в мин время выхода пика индола составляло 3,03-3,2 мин. Количество индола в образце вычисляли по формуле:

где y количество ¹⁴N-индола, x количество ¹⁵N-индола, C начальная удельная активность внутреннего стандарта, принимаемая за 100% C конечная удельная активность, вычисляемая как соотношение площади пика иона с m/e 118 (молекулярный ион ¹⁵N-индола) к сумме площадей пиков 117+118 (молекулярный ион ¹⁴N-индола с m/e 117). Потери при выделении, концентрации и очистке индола не превышали 25% Рисунки 1 и 2 иллюстрируют масс-спектры и хроматограммы стандартов ¹⁴N-индола и ¹⁵N-индола, возогнанных из воды и сконцентрированных на колонке C₁₈ по заявляемому способу.

Пример 2. Жидкий эндосперм кукурузы в объеме 100 или 150 мл помещали в колбу на 1 л и вносили 2,0 мкг ¹⁵N-индола в объеме 50 мкл 50% изопропанола и пропускали пар со скоростью 50 мл/мин. Собирали 15 мл конденсата в течение 15 мин пропускания пара через слой жидкости эндосперма. Для анализа использовали жидкий эндосперм, подученный из початков через 2 недели, 1 и 2 месяца после опыления. Дальнейшее выделение, очистку и хроматографирование индола осуществляли способом, описанным в примере 1. Анализ содержания индола в образцах эндосперма проводили в 2-3 повторностях (табл. 1).

На фиг. 3 и 4 представлены масс -спектры и хроматограммы индола, выделенного из жидкого эндосперма по заявляемому способу, полученного из зерновок кукурузы через 1 месяц поcле опыления.

Пример 3. 3ерна (60 г) срезали с початков кукурузы перед опылением, насыпали в колбу и заливали 100 мл бидистиллированной воды. В качестве внутреннего стандарта добавляли ¹⁵N-индол 0,2 мкг в 50% изопропаноле. Дальнейшие процедуры и количественное определение содержания индола проводили по заявляемому способу, указанному в примере 1 (табл. 2).

Пример 4. Пыльники собирали в момент их раскрытия перед началом опыления в теплую сухую погоду. Для анализа использовали навески пыльников в 10 или 15 г. Навеску пыльников помещали в колбу для паровой возгонки и заливали 75-100 мл бидистиллированной воды, добавляли 20 мкг ¹⁵N-индола в 50% растворе изопропанола. Дальнейшие процедуры проводили способом, указанном в примере 1 (табл. 3).

Пример 5. Рыльца собирали в момент опыления початков кукурузы. Навеску в 20 г помещали в колбу для паровой возгонки и заливали 100 мл бидистиллированной воды. Затем добавляли 2,0 мкг ¹⁵N-индола в 50% растворе изопропанола. Процедуру выделения и количественного определения индола осуществляли по заявляемому способу, указанному в примере 1 (табл. 4).

Пример 6. Листья кукурузы собирали перед началом опыления, нарезали ножницами, навеску в 20 г помещали в колбу, приливали 100 мл бидистиллированной воды, вносили 0,2 мкг ¹⁵N-индола и проводили процедуры по выделению индола и его количественного определения по заявляемому способу, указанному в примере 1 (табл. 5).

Пример 7. Цветы Hemerocallis sp. Petunia sp. Rosa sp. собирали в теплый сухой вечер после ясного солнечного дня в момент их интенсивного благоухания. Навески неповрежденных цветов (свежих или замороженных) в 7-10 г помещали в колбу, заливали 100 мл бидистиллированной воды и добавляли 20 мкг ¹⁵N-индола. Процедуру возгонки индола паром из смеси цветов с водой и количественное определение проводили по заявляемому способу, описанному в примере 1 (табл. 6).

Использование: изобретение предназначено для определения индола в растительном материале. Сущность изобретения: выделение индола из растительного материала проводят путем возгонки с помощью водяного пара и конденсации в виде водного раствора. Концентрируют конденсат на колонке с сорбентом силасорб C₁₈. Анализ проводят с помощью газожидкостной хроматографии с использованием ¹⁵N-индола в качестве внутреннего стандарта и масс -спектрального или пламенно -ионизационного детектора. 4 ил., 6 табл.

Способ определения содержания индола в растительном материале, включающий выделение его из пробы растительного материала и его анализ, отличающийся тем, что выделение индола из растительного материала проводят путем возгонки с помощью водяного пара и конденсации в виде водного раствора, дополнительно концентрируют конденсат на колонке с сорбентом силасорб С 18, а анализ проводят с помощью газожидкостной хроматографии с использованием 15-N-индола в качестве внутреннего стандарта и масс-спектрального или пламенно-ионизационного детектора.