СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТИОЛ:ПРОТЕИН-ДИСУЛЬФИД ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ ИЗ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ Российский патент 2007 года по МПК C12N9/00 C12N9/02 

Изобретение относится к биохимии растений, а именно, к энзимологии, к выделению фермента тиолдисульфидного обмена из растений, и может найти применение в биотехнологии, в отраслях пищевой промышленности, при разработке оценки качества зерна и продуктов на его основе.

Технологические свойства клейковины различных сортов пшеницы находятся в корреляционной зависимости от активности ферментов, определяющих SH/S-S-статус запасных белков зерна пшеницы.

Ферменты тиол-дисульфидного обмена участвуют в создании этого статуса. Одним из таких ферментов является тиол:протеин-дисульфид оксидоредуктаза (ЕС 1.8.4.2).

Известен способ выделения фермента протеин дисульфид изомеразы из эндосперма развивающейся зерновки пшеницы [Shimoni Y. et. al. Purification, Characterization, and Intracellular Localization of Glycosylated Protein Disulfide Isomerase from Wheat Grains // Plant Physiol. - 1995. - (108). 327-335].

Известный способ позволил получить определенные данные по влиянию протеин дисульфид изомеразы (ПДИ) на свертывание и ассоциацию запасных белков развивающегося зерна пшеницы. При этом количество фермента, выделенное известным способом, оставляет вопрос о влиянии этого фермента на фолдинг и накопление протеина в зерне не достаточно выясненным.

Известны способы выделения и очистки фермента тиол:протеин-дисульфид оксидоредуктазы (ЕС 1.8.4.2), систематическое название - глутатион-инсулин трансгидрогеназа, совместно с протеин дисульфид изомеразой (ЕС 5.3.4.1) из тканей животных, при которых ткани животных объектов разрушают гомогенизированием, с последующим получением супернатанта центрифугированием, затем фракционированием с использованием сульфата аммония и дальнейшей очисткой полученного ферментного экстракта хроматографией [D.A.Hillson and R.B.Freedman Purification of protein disulphide-isomerase and glutathione-insulin transhydrogenase activities by covalent chromatography // Biochem J. - 1980. - 191. - p.373-388; Chandler M.L. Insulin degradation. The widespread distribution of glutathione-insulin transhydrogenase in the tissues of the rat // Biochem. Biophys. Acta. - 1972. - p.286].

Фермент (тиол:протеин-дисульфид оксидоредуктаза) (ЕС 1.8.4.2) выделен и очищен до гомогенности, в частности, из печени быка [Carmichael D.F., Morin J.E., Dixon J.E. 1977. Purification and characterization of a thiol:protein disulphide oxidoreductase from bovine liver. J. Biol. Chem. 252, p.7163-7167].

Сведений о выделении и дистанцировании тиол:протеиндисульфидоксидоредуктазы ТПДО (ЕС 1.8.4.2) из растительных объектов в настоящее время не выявлено.

Важная роль тиолдисульфидного обмена в функционировании клеток обусловила выделение этих ферментов из тканей микроорганизмов и животных для изучения их ферментативной активности. Физиологическая роль ферментов тиол-дисульфидного обмена, по-видимому, заключается в регуляции процессов посттрансляционной модификации белковых молекул, в поддержании окислительно-восстановительного потенциала клетки [Кузнецов А.Н., Труфанов В.А. Тиол:протеин-дисульфид оксидоредуктазная активность созревающих семян пшеницы // Известия Сибирского отделения Академии Наук СССР. - Серия биологических наук. - 1981. - Вып.3. - С.86-89].

Изменение ферментативной активности в созревающей зерновке пшеницы связывают с участием ферментов тиолдисульфидного обмена в биохимических процессах формирования надмолекулярных структур запасных белков.

Выделение и очистка из растительного сырья фермента, подобного инсулин трансгидрогеназе животных объектов, может обеспечить возможность определения физиологической роли фермента в метаболизме растительной клетки.

Задачей изобретения является определение молекулярной массы фермента, его энзиматических характеристик, степени влияния на агрегацию клейковинных белков, а также роли в создании и регуляции SH/S-S-статуса белков эндосперма пшеницы.

Технический результат изобретения заключается в выделении значимых количеств однородного (гомогенного) целевого продукта для научного и практического использования.

Техническим результатом изобретения является применение нативных регуляторных свойств фермента тиол:протеин-дисульфид оксидоредуктазы (ЕС 1.8.4.2) в отраслях, производящих и использующих зерновые культуры, например, для улучшения технологических свойств пшеницы, при формировании реологических свойств клейковины пшеницы для создания возможности регулирования качества муки и реологических свойств теста, для придания тесту заданных свойств, например, для увеличения растяжимости теста.

Технический результат обеспечивает способ получения тиол:протеин-дисульфид оксидоредуктазы, при котором для выделения фермента используют сырье из злаковых культур, в качестве которого используют муку из зерна пшеницы Triticum aestivum L.

Экстрагирование белковых структур сырья проводят водным раствором с добавлением химических реагентов для защиты SH-групп. Полученный гомогенат отделяют от твердой фазы и затем центрифугируют.

Выделенный в результате центрифугирования супернатант последовательно дважды фракционируют осадителем, в качестве которого используют сульфат аммония. После первого фракционирования отделяют осадок, а полученный супернатант снова фракционируют, после чего отделяют осадок и ресуспендируют его в 0,1 М трис-HCl буферном растворе рН 8,0, содержащем ЭДТА. Ресуспендированный осадок разделяют на центрифуге с выделением неочищенного целевого продукта, который обессоливают на колонке с сефадексом.

Выделенный экстракт очищают с применением ионообменной хроматографии с последующим применением рехроматографии с получением очищенного целевого продукта.

Экстрагирование белковых структур сырья проводят при непрерывном помешивании муки и водного раствора, взятых в количественном соотношении 1:3 соответственно, в качестве химических реагентов для защиты SH-групп используют ЭДТА и ДТТ в необходимых для проявления их действия количествах.

Отделенный от твердой фазы гомогенат центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 15-30 минут с получением супернатанта.

При первом фракционировании супернатанта сульфатом аммония концентрация его составляет 20%.

После отделения жидкой фазы центрифугированием, проводят второе фракционирование сульфатом аммония при концентрации его, равной 70%.

Ресуспендированный осадок разделяют на центрифуге при 10000-14000 об/мин в течение 10-15 мин с выделением неочищенного целевого продукта.

Всю цепочку операций по выделению неочищенного целевого продукта проводят при температуре от 0 до +4°С.

Очистку экстракта целевого продукта осуществляют с применением ионообменной хроматографии на сефадексе ДЕАЕ А-50 в 0,1 М трис-HCL буфере, рН 8,0, содержащем 1 мМ ЭДТА с последующей рехроматографией целевого продукта.

Ионообменную хроматографию проводят также с использованием фосфатного буфера.

Рехроматографию целевого продукта проводят на колонке с седафексом ДЕАЕ А-50 в 0,1 М трис-HCl буфере, рН 8,0, а десорбцию белков ведут в линейном градиенте концентрации NaCl 0-0,6 М.

Очистку экстракта фермента осуществляют при температурном режиме от 0 до +4°С.

Очищенный однородный фермент лиофильно высушивают.

Полученный заявляемым способом фермент используют в качестве добавки для пищевых продуктов. Например, для регулирования технологических качеств и реологических свойств разного вида теста.

Фермент тиол:протеин-дисульфид оксидоредуктаза получен заявляемым способом из растительного сырья впервые.

Способ позволяет получить фермент с разными степенями очистки.

Выделение фермента тиол:протеин дисульфид оксидоредуктазы высокой очистки из зерна пшеницы дает возможность определить его физико-химические свойства, энзиматические характеристики и молекулярную массу.

Физические свойства клейковины пшеницы в значительной мере зависят от содержания в запасных белках внутри- и межмолекулярных S-S-связей, определяющих и стабилизирующих пространственную структуру белкового комплекса клейковины [Труфанов В.А. Тиолоксидазная и дисульфидредуктазная активности зерновки пшеницы Triticum aestivum L. и ее технологические качества / Труфанов В.А., Кичатинова С.В., Казарцева А.Т. и Пермяков А.В. // Прикладная биохимия и микробиология. - 2000. - Т.36. - №1. - С.89-92].

Исследованиями установлено увеличение содержания SH-групп по отношению к количеству, имеющемуся в исходном субстрате при прямом воздействии выделенного неочищенного фермента на растворимую фракцию белков клейковины пшеницы.

Высокое содержание фермента и/или его высокая активность определяют такую важную качественную характеристику муки из зерна, как растяжимость теста. Этот фактор не всегда желателен при хлебопечении.

Осуществление изобретения открывает возможность выявить степень влияния фермента на процесс формирования комплекса запасных белков пшеницы, определяющий реологические свойства клейковины.

Возможность определения локализации его гена необходима для учета влияния активности фермента на технологические свойства пшениц с целью использования при решении широкого спектра задач, в том числе, в хромосомной инженерии.

Полученный целевой продукт в виде тиол:протеиндисульфид оксидоредуктазы используют при изучении биохимических процессов растительной клетки, в частности, фолдинга белка.

Небольшие количества выделенного заявленным способом фермента позволяют использовать его для молекулярно-биологических исследований с последующей биотехнологической наработкой чистого фермента.

Изобретение может быть использовано при разработке оценки качества зерна, в основе которой заложено отношение активности ферментов, окисляющих SH-группы к активности ферментов, восстанавливающих S-S-связи (OX/RED).

Пример 1.

Для получения фермента используют муку грубого помола пшеницы сорта Тулунская 12 полной спелости. Для экстракции белковых структур в качестве экстрагента используют водный раствор, содержащий 2 мМ ЭДТА и 1 мМ ДТТ.

150 г муки + 450 мл H₂O + 2 мМ ЭДТА и 1 мМ ДТТ

Экстрагирование ведут при постоянном перемешивании в течение 20 минут. Использование в качестве экстрагента указанного водного раствора позволяет уже на этой стадии провести частичную очистку выделяемого фермента от глобулярных белков.

Полученный гомогенат отжимают, пропуская через капрон, затем центрифугируют в бакет-роторе при 3,5 тыс. об/мин в течение 20 мин. Полученный супернатант подвергают воздействию сульфатом аммония при 20%-ном насыщении по схеме:

300 мл супернатанта + 32 г (NH₄)₂SO₄

После осаждения проводят центрифугирование при 3 тыс. об/мин в течение 20 минут. Осадок отбрасывают, а полученный супернатант снова фракционируют сульфатом аммония большей концентрации (при 70% насыщения).

300 мл полученного супернатанта + 107 г (NH₄)₂SO₄

Массу разделяют на центрифуге. Осадок, содержащий водорастворимый белок, ресуспендируют в буферном растворе, содержащем 60 мл 0,1 М трис-HCl, рН 8,0 с 1 мМ ЭДТА. Ресуспендированный осадок разделяют на центрифуге при 14000 об/мин в течение 10 мин.

Все операции по выделению неочищенного целевого продукта ведут в температурном интервале от 0° до +4°С.

Обессоливание проводят гель-фильтрацией на колонке с сефадексом Г-25 при комнатной температуре, получая экстракт целевого продукта.

Тонкую очистку экстракта фермента проводят с применением ионообменной хроматографии на сефадексе ДЕАЕ А-50 в 0,1 М трис-HCl буфере с повторной рехроматографией выделенных белковых фракций на колонке размером 0,8×2,5 см, с ДЕАЕ-сефадексом А-50, используя тот же буфер. При рехроматографии в линейном градиенте NaCl происходит разделение системы ферментов и наблюдается достаточно высокая степень очистки выделяемого фермента. Рехроматографию полученных белковых препаратов проводят при температуре +4°С.

Гомогенность полученного в результате рехроматографии ферментного препарата подтверждают методом капиллярного электрофореза.

Очищенный экстракт фермента используют в жидком виде или лиофильно высушивают.

Исследования показали существенные отличия полученного в результате осуществления способа фермента от аналогичных по функциям ферментов тиолдисульфидного метаболизма пшеницы. Для выделенного фермента оптимальная температура для проявления протеиндисульфидредуктазной активности составляет интервал от 33 до 38°С.

Пример 2.

Целевой продукт выделяют способом, приведенным в примере 1, используя для получения фермента муку сорта Новосибирская 67. Центрифугирование отжатого гомогената на стадии экстракции водорастворимого белка водным раствором с добавлением необходимого количества ЭДТА и ДТТ проводят при 4, 5 тыс. об/мин в течение 18 мин.

При очистке целевого продукта с применением ионообменной хроматографии используют фосфатный буфер.

Для определения молекулярной массы впервые выделенного очищенного фермента тиол:протеин дисульфидоксидоредуктазы (ТПДО) из зерна пшеницы используют метод недетурирующего электрофореза в присутствии ДДС-Na по методике А.В.Колесниченко [Колесниченко А.В., Побежимова Т.П., Войников В.К. Характеристика белков низкотемпературного стресса растений // Физиология растений. - 2000. - 47. - С.624-630].

Анализ фракций с дисульфидредуктазной активностью в 7% ПААГ показал электрофоретическую гомогенность нативного белка с молекулярной массой около 167 кДа.

При восстановлении нативной дисульфидредуктазы 5%-ным β-меркаптоэтанолом в присутствии 2%-ного ДДС-Na ее молекула диссоциирует на две субъединицы с молекулярными массами около 73 и 77 кДа.

Выделенный фермент имеет более высокую молекулярную массу как нативного белка, так и отдельных субъединиц по сравнению с ранее описанными глутатионзависимыми протеиндисульфидредуктазами животных объектов.

Эти значения оказались выше значений молекулярных масс известных ферментов SH-метаболизма в зерновке пшеницы [Shimoni et. al. (1995) Plant Physiol., 108, p.327-335; Suske С., Wagner W., Follmann H NADFH-dependent thioredoxin reductase and a new thioredoxin from wheat // Z.Naturforsch. - 1979. - (34). - 214-221].

Исследования по воздействию выделенного фермента на процессы, регулирующие качество клейковины зерна и реологические свойства теста, показали достаточно высокую его активность.

Одним из важных показателей качества клейковины, определяющих реологические свойства теста, является способность запасных белков к агрегации. Время агрегации и оптическую плотность клейковины определяли при воздействии выделенного фермента на уксусно-растворимую фракцию запасных белков пшеницы.

Клейковину из обезжиренной муки отмывали 0,1 М раствором пирофосфата Na, pH 7,0, затем водой. Сырую клейковину растворяли в 0,1 М уксусной кислоте и высушивали лиофильно. В контроле смешивали равные объемы раствора клейковинных белков в уксусной кислоте и буферного раствора. В опыте добавляли фермент ТПДО (3-5 ед. активности). Оптическую плотность определяли спектрофотометрически при длине волны, равной 350 нм.

На Фиг.1 и 2 представлены агрегационные кривые уксусно-растворимых белков пшеницы Тулунская 12.

Кривая 1 описывает контроль без добавления фермента, кривая 2 - с добавлением фермента. На Фиг.1 показаны значения при pH 5,6; на Фиг.2 - отражены показатели при оптимальном для проявления активности фермента значении, равном pH 7,5.

Снижение показателей агрегации при добавлении фермента указывает на диссоциацию S-S-связей белков и ослабление вследствие этого жесткости клейковинного матрикса.

Полученный заявляемым способом фермент использовали в качестве добавки к муке.

Для определения степени воздействия полученного фермента на свойства муки и получаемого из нее теста проводили опытные замесы с использованием муки без фермента и с добавлением фермента.

К 50 г муки сорта Мироновская 808 урожая 2003 г. добавляли 50 мг ферментного препарата, содержащего 0,15 мг чистого фермента. Замес осуществляли при температуре 25°С и длительности 6 мин.

Определяли такие показатели, как сила муки, упругость и растяжимость теста. Полученные данные приведены в таблице.

Значения всех исследуемых характеристик муки и теста в опытах с ферментом оказались выше контрольных.

Целевой продукт при добавлении его в муку влияет на изменение качественных характеристик теста, повышая, например, его растяжимость, придает тем самым тесту иные технологические свойства.

Изменение технологических качеств продуктов из теста или продуктов с добавлением муки влечет за собой изменение свойств изделий. Например, при снижении содержания муки в изделии можно повысить его пищевую ценность.

Заявляемый способ позволяет получить достаточное количество высокоочищенного гомогенного фермента из разных сортов пшеницы, других зерновых культур и иных растений, имеющих дисульфидредуктазную активность.

Источники информации

CARMICHAEL D.F. Purification and characterization of thiol:protein disulfide oxidoreductase from bovine liver / D.F.Carmichael, J.E.Morin, J.E.Dixon // J. Biol. Chem. - 1977. - P.7163-7167.

ТРУФАНОВ В.А. Тиолоксидная и дисульфидредуктазная активности зерновки пшеницы Triticum aestivum L. и ее технологические качества / В.А.Труфанов, С.В.Кичатинова, А.Т.Казарцева и А.В.Пермяков // Прикладная биохимия и микробиология. - 2000. - Т.36. - №1. - С.89-92.

CHANDLER M.L. Insulin degradation. The widespread distribution of glutathione-insulin transhydrogenase in the tissues of the rat / M.L.Chandler and P.T.Varandani // Biochim. Biophys. Acta. - 1972. - 286.

HILSON D.A. Purification of protein disulphide-isomerase and glutathione-insulin transhydrogenase activities by covalent chromatography / D.A.Hilson and R.B.Freedman // Biochem. J. - 1980. - V.191. - P.373-388.

ТРУФАНОВ В.А. Дисульфидредуктазная и тиолоксидазная активности в зависимости от содержания низкомолекулярных тиолов в развивающейся зерновке пшеницы / В.А.Труфанов, А.В.Пермяков и С.В.Кичатинова // Прикладная биохимия и микробиология. - 1993. - Т.29. - Вып.5. - С.728-732.

SHIMONI Y. et. al. Purification, Characterization, and Intracellular Localization of Glycosylated Protein Disulfide Isomerase from Wheat Grains // Plant Physiol. - 1995. - 108. - P.327-335.

ЦЫПЕРОВИЧ А.С. Ферменты. - Киев: Техника, 1971. - С.138-169.

ГРАЧЕВА И.М. Технология ферментных препаратов / И.М.Грачева и А.Ю.Кривова. - М.: ЭЛЕВАР, 2000. - С.127-150.

Растительный белок / Под ред. Т.П.МИКУЛОВИЧ. - М., 1991. - С.76-88; С.176-221.

АНГЕЛОВА B.C. Выделение растворимых белков из зародышей семян пшеницы разной жизнеспособности / В.С.Ангелова и В.П.Холодова // Физиология растений. - 1993. - Т.4. - №6. - С.889-892.

Изобретение относится к энзимологии и может быть использовано при оценке качества зерна и продуктов на его основе. Способ предусматривает получение гомогената из муки грубого помола пшеницы Triticum aestiivum L., путем экстрагирования белковых структур водным раствором, содержащим химические реагенты - ЭДТА и ДТТ. Экстракцию ведут при непрерывном перемешивании муки и водного раствора, в соотношении 1:3. Полученный экстракт отделяют от твердой фазы центрифугированием при 3000-5000 об/мин в течение 15-30 мин. Полученный супернатант дважды фракционируют. Первое фракционирование осуществляют при 20%-ном насыщении раствора сульфатом аммония; второе - при 70%-ном насыщении с отделением осадка центрифугированием после первого и второго фракционирования. Осадок, полученный после фракционирования, ресуспендируют в 0,1 М трис - HCl буфере, содержащем ЭДТА, и отделяют центрифугированием при 10000 - 14000 об/мин. Выделенный целевой неочищенный продукт высаливают на колонке с сефадексом. Экстракт очищают ионообменной хроматографией на колонке с сефадексом ДЕАЕ А50 в 0,1 М трис - HCl буфере, содержащем ЭДТА с последующей рехроматографией целевого продукта на колонке с сефадексом ДЕАЕ А50 в 0,1 М трис - HCl буфере, содержащем ЭДТА. Очищенный экстракт лиофильно высушивают. Изобретение позволяет получить и выделить фермент с различными степенями очистки. 10 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл.

1. Способ получения тиол:протеин-дисульфид оксидоредуктазы, характеризующийся тем, что для выделения фермента используют растительное сырье, в качестве которого используют муку из пшеницы вида Triticum aestivum L., проводят экстрагирование белковых структур сырья водным раствором с добавлением химических реагентов для защиты SH-групп, полученный гомогенат отделяют от твердой фазы и затем центрифугируют, после чего полученный супернатант последовательно дважды фракционируют сульфатом аммония с отделением осадка после первого и второго фракционирования, полученный осадок ресуспендируют в 0,1 М трис-HCl буферном растворе рН 8,0, содержащем ЭДТА и разделяют на центрифуге с выделением неочищенного целевого продукта, который обессоливают на колонке с сефадексом, полученный экстракт очищают с применением ионообменной хроматографии и с последующей рехроматографией целевого продукта.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что экстрагирование проводят при непрерывном помешивании муки и водного раствора при количественном соотношении компонентов 1:3, в качестве химических реагентов для защиты SH-групп используют ЭДТА и ДТТ.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что отделенный от твердой фазы гомогенат центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 15-30 мин с получением супернатанта.4. Способ по п.1, отличающийся тем, что при первом фракционировании супернатанта осадителем насыщение сульфатом аммония составляет 20%, а после отделения жидкой фазы центрифугированием проводят второе фракционирование сульфатом аммония при 70% насыщении.5. Способ по п.1, отличающийся тем, что ресуспендированный осадок разделяют на центрифуге при 10000-14000 об/мин в течение 10-15 мин с выделением неочищенного целевого продукта.6. Способ по п.1, отличающийся тем, что все операции по выделению неочищенного целевого продукта проводят при температуре от 0 до 4°С.7. Способ по п.1, отличающийся тем, что очистку экстракта целевого продукта проводят с применением ионообменной хроматографии на сефадексе ДЕАЕ А-50 в 0,1 М трис-HCL буфере рН 8,0, содержащем 1 мМ ЭДТА или используют фосфатный буфер с последующей рехроматографией целевого продукта.8. Способ по п.7, отличающийся тем, что рехроматографию целевого продукта проводят на колонке с сефадексом ДЕАЕ А-50 в буфере, а десорбцию белков ведут в линейном градиенте концентрации NaCl - 0,6 М.9. Способ по п.7, отличающийся тем, что очистку экстракта целевого продукта осуществляют при 0 - 4°С.10. Способ по любому из п.1 или 7, отличающийся тем, что очищенный экстракт целевого продукта лиофильно высушивают.11. Способ по любому из пп.1-10, отличающийся тем, что выделяют фермент и применяют, в частности, для регулирования технологических качеств и свойств пищевых продуктов, получаемых с использованием муки.