ИММУНОСТИМУЛЯТОР Российский патент 2004 года по МПК A61K31/205 A61P37/04 

Изобретение относится к новым биологически активным веществам из класса производных алканкарбоновых кислот.

Известна трис-(2-гидроксиэтил) аммониевая соль 4-хлорфенилсульфонил уксусной кислоты (Г.Г.Левковская и др. Двухядерные производные фенилтио-уксусной кислоты. “Химико-фармацевтический журнал”, 1984, №4, с.431-436), используемая в качестве стимулятора роста ячменного солода (авт. св. СССР №1253973, С 07 С 147/08, 1986).

Целью изобретения является создание новых эффективных иммуноактивных веществ на основе класса алканкарбоновых кислот, к которому относится и трис-(2-гидроксиэтил) аммониевая соль 4-хлорфенилсульфонил уксусной кислоты.

Выраженные стимулирующие свойства трис-(2-гидроксиэтил) аммониевой соли 4-хлорфенилсульфонил уксусной кислоты в отношении основных систем иммунитета свидетельствуют о возможности создания на ее основе нового класса эффективных лекарственных средств - иммуностимуляторов за счет выявления новых, ранее неизвестных свойств.

Для достижения цели использовался раствор трис-(2-гидроксиэтил) аммониевой соли 4-хлорфенилсульфонил уксусной кислоты различной концентрации, который вводили опытным животным внутрибрюшинно ежедневно в течение 5 дней. В день последнего введения вещества животных иммунизировали (вводили антиген для стимуляции иммунного ответа). В работе использовали здоровых половозрелых животных мышей - гибридов (CBA×C57BL/6)F1 (CBF1) обоего пола, 8-10 - недельного возраста, массой тела 18-20 г. Разброс в группах по исходной массе тела не превышал ±10%. Контрольные и опытные животные одного возраста и получены одновременно из одного питомника ("Рассвет", г. Томск). До и в период эксперимента контрольные и опытные животные содержались в виварии в одинаковых условиях: стандартных пластиковых клетках с мелкой древесной стружкой (не более 10 особей) на стандартном рационе. Все исследования проводились в одно и то же время суток (утром). Полученные данные обрабатывались по непараметрическому критерию.

Пример 1. Количество IgM и IgG антителообразующих клеток (АОК) in vivo

Опытной группе животных вводили трис-(2-гидроксиэтил) аммониевую соль 4-хлорфенилсульфонил уксусной кислоты в дозе 30 мг/кг (1/100 LD₅₀) внутрибрюшинно ежедневно в течение 5 дней в объеме 0,5 мл. Контрольным животным в таком же объеме и режиме вводили растворитель (воду). В день последнего введения трис-(2-гидроксиэтил) аммониевой соли 4-хлорфенилсульфонил уксусной кислоты животных иммунизировали внутривенно эритроцитами барана (ЭБ) в дозе 0,5·10⁷/мышь. Количество IgM АОК в селезенке мышей оценивали на 4-е сутки после иммунизации по количеству локальных зон гемолиза в полужидкой среде модифицированным методом (Cunningham, 1968). Влияние трис-(2-гидроксиэтил) аммониевой соли 4-хлорфенилсульфонил уксусной кислоты оценивали на индуктивную фазу IgM антителообразования. Для определения IgG АОК (Cunningham, 1968; Dresser, Wortis, 1965) первичную иммунизацию проводили внутрибрюшинно, вторичную - внутривенно в дозе 0,5·10⁷ ЭБ/мышь. Для оценки величины гуморального иммунного ответа подсчитывали количество IgG АОК в селезенке мышей на пике иммунного ответа методом локального гемолиза. Клетки селезенки инкубировали 2 ч при 39°С в камерах с ЭБ, комплементом морской свинки и кроличьей антисывороткой против мышиного IgG (разведение в 2000 раз). Зоны гемолиза подсчитывали под увеличением ×42.

Как видно из данных таблицы 1, трис-(2-гидроксиэтил) аммониевая соль 4-хлорфенилсульфонил уксусной кислоты стимулирует первичный и вторичный гуморальный иммунный ответ.

Пример 2. Реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) in vivo

Опытной группе животных трис-(2-гидроксиэтил) аммониевую соль 4-хлорфенилсульфонил уксусной кислоты вводили в дозе 30 мг/кг (1/100 LD₅₀) внутрибрюшинно ежедневно в течение 5 дней в объеме 0,5 мл. В день последнего введения трис-(2-гидроксиэтил) аммониевой соли 4-хлорфенилсульфонил уксусной кислоты мышей сенсибилизировали внутрибрюшинным введением 0,25% ЭБ в объеме 0,5 мл; на 4-е сутки после сенсибилизации вводили разрешающую дозу антигена под подошвенный апоневроз правой задней лапы (50% ЭБ в объеме 50 мкл). В контрлатеральную лапу вводили растворитель в том же объеме. Контрольным животным в таком же объеме и режиме вводили растворитель трис-(2-гидроксиэтил)аммониевая соль 4-хлорфенилсульфонил уксусной кислоты (воду). Реакцию ГЗТ оценивали по методике локальной ГЗТ (Crowle, 1975). Учет реакции производили через 24 ч после введения разрешающей дозы ЭБ, величину отека оценивали штангенциркулем. Результаты выражали в процентах или абсолютных значениях.

Как видно из данных табл. 2, трис-(2-гидроксиэтил) аммониевая соль 4-хлорфенилсульфонил уксусной кислоты на 38% стимулирует ГЗТ.

Пример 3. Fc-рецептор опосредованный фагоцитоз макрофагов

Фагоцитарную активность под влиянием трис-(2-гидроксиэтил) аммониевой соли 4-хлорфенилсульфонил уксусной кислоты определяли спектрофотометрическим микрометодом Fc-рецептор опосредованного фагоцитоза эритроцитов барана макрофагами (Rummage et al., 1985). Опытной группе животных трис-(2-гидроксиэтил) аммониевую соль 4-хлорфенилсульфонил уксусной кислоты вводили внутрибрюшинно в дозе 30 мг/кг (1/100 LD₅₀) ежедневно в течение 5 дней в объеме 0,5 мл. Контрольным животным в таком же объеме и режиме вводили растворитель (воду). В день последнего введения трис-(2-гидроксиэтил) аммониевой соли 4-хлорфенилсульфонил уксусной кислоты животным внутрибрюшинно вводили 10% р-р пептона. На 4-е сутки выделяли клетки перитонеального экссудата. Макрофаги брюшной полости, стимулированные пептоном, культивировали в концентрации 2·10⁶/мл в течение 24 ч в 24-луночных пластиковых планшетах в среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 10мМ HEPES, 2мМ L-глютамина при температуре 37°С в атмосфере высокой влажности с содержанием 5%СО₂ в воздухе. Затем к монослою макрофагов добавляли 1 мл 2,5% опсонизированных ЭБ и культивировали в тех же условиях в течение 40 мин. После этого нефагоцитированные ЭБ лизировали гипотоническим раствором NaCl. Для разрушения макрофагов и фагоцитированных ими ЭБ в каждую лунку добавляли 0,6 мл 1% р-ра содиум додецил сульфата (детергент), после чего количество гемоглобина, вышедшего из разрушенных ЭБ, определяли спектрофотометрически на “MULTISCAN” при длине волны 405 нм. Фагоцитарная активность определялась индивидуально у каждой мыши.

Как видно из данных табл., 3 под действием трис-(2-гидроксиэтил) аммониевой соли 4-хлорфенилсульфонил уксусной кислоты стимулируется Fc-опосредованный фагоцитоз макрофагов по сравнению с интактными животными.

Оценивая в целом результаты, можно отметить, что по способности стимулировать первичный и вторичный гуморальный иммунный ответ, ГЗТ, фагоцитарную активность макрофагов трис-(2-гидроксиэтил) аммониевая соль 4-хлорфенилсульфонил уксусной кислоты может быть отнесена к иммуностимуляторам.

Трис-(2-гидроксиэтил) аммониевая соль 4-хлорфенилсульфонил уксусной кислоты нетоксична для теплокровных животных и обладает выраженным иммуностимулирующим действием. Учитывая доступность и низкую стоимость трис-(2-гидроксиэтил) аммониевой соли 4-хлорфенилсульфонил уксусной кислоты, она перспективна для создания иммуностимулирующих лекарственных средств.

Предложено: применение трис-(2-гидроксиэтил)аммониевой соли 4-хлорфенилсульфонилуксусной кислоты в качестве иммуностимулятора, ранее известной как стимулятор роста микроорганизмов или как ингибитор агрегации тромбоцитов. Изобретение расширяет арсенал средств заявленного назначения. 3 табл.

Применение трис-(2-гидроксиэтил)аммониевой соли 4-хлорфенилсульфонилуксусной кислоты в качестве иммунодепрессанта.