СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ДЛЯ ИНДИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ КОКЛЮША В ЖИДКОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ Российский патент 1997 года по МПК G01N33/569 A61K39/10 G01N33/545 G01N33/546 G01N33/547 

Изобретение относится к области микробиологии, а именно к получению препарата, необходимого для проведения иммунологического анализа с целью индикации возбудителя коклюша.

Указанный препарат необходим:
для выявления коклюшной этиологии заболевания и носительства возбудителя коклюша;
для контроля за эффективностью лечения больных коклюшем и санации носителей возбудителя коклюша;
для оценки эффективности профилактических и противоэпидемических мероприятий.

Из аналогов известен способ получения препарата для идентификации микробов рода Bordetella, изложенный в статье (Бакулина Н.А. Мамаева Е.А. Букина Т. В. Бевз Н.И. Метод коагглютинации в идентификации микробов рода Bordetella. Лабораторное дело, 1989, N 7, с. 68 70). Способ основан на использовании в качестве носителя стафилококкового A-протеина, что усложняет технологию изготовления препарата и не обеспечивает его высокое качество.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому является способ, который описан в заявке на изобретение Японии N 63-52708, согласно которому возможно получить препарат для индикации возбудителя коклюша. Указанный способ принят авторами за прототип. По прототипу препарат получают путем иммобилизации антител-гаммаглобулинов, иммунных к Bordetella pertusis на поверхности частиц латекса, получаемого на основе полистирола. Прототип основан на реакции латексной агглютинации. Недостатком прототипа является сложность технологии получения препарата, заключающаяся в необходимости двукратной обработки латексных частиц составами, включающими антитела, с целью их иммобилизации.

Техническая сущность заявляемого способа состоит в том, что целевой препарат получают путем сорбции высокоочищенных, иммунных к возбудителю коклюша гаммаглобулинов на частицах латекса, получаемого из полистирола, модифицированного метакриловой кислотой и метакрилатом цинка.

Процесс включает следующие операции:
1. Смешение антитела-гаммаглобулина, иммунного к возбудителю коклюша, разбавленного 0,05 М глицино-солевым буферным раствором с pH 8,2, с латексом, разбавленным тем же буферным раствором до содержания латекса в буферном растворе 1% в расчете на полимер. Применяемый латекс представляет собой смесь полистирола, активированного метакрилатом цинка с объемным включением, с дисперсностью 0,2- 0,25 мкм и полистирола карбоксилированного с дисперсностью 1,1 1,2 мкм. Объемное соотношение указанных латексов в смеси равно 1 1.

2. Полученную по п. 1 смесь инкубируют при 56^oC в течение 45 мин.

3. Смесь, полученную по п. 2, охлаждают до (4 6)^oC.

4. Охлажденную смесь смешивают с бычьим сывороточным альбумином, предварительно разбавленным 0,05 М глициново-солевым буферным раствором с pH 8,2, до концентрации 0,1%
5. В смесь, полученную по п. 4, вводят полиэтиленгликоль-6000 и консервант.

6. Компоненты, необходимые для приготовления целевого препарата, берут в следующем соотношении в г/л:
Гаммаглобулин, иммунный к возбудителю коклюша 0,18 0,20
Смесь латексов 2,50 2,55
Бычий сывороточный альбумин 0,50 0,55
Полиэтиленгликоль-6000 55,0 60,0
Консервант (азид натрия или мертиолят) 0,1 1,0
0,05 М глициново-солевой буферный раствор с pH 8,2 8,25 До 1 литра
Предлагаемый способ несложен и обеспечивает получение высокочувствительного препарата.

Авторы утверждают, что предлагаемый способ соответствует критерию изобретения "Изобретательский уровень", так как на основании ознакомления с научно-технической и патентной информацией, а также в силу своих опыта и знаний, вся совокупность технических признаков заявляемого способа явным образом не вытекает из уровня техники, имеющей отношение к предлагаемому объекту.

Способ осуществляется следующим образом:
1. Гаммаглобулин, иммунный к возбудителю коклюша, разводят 0,05 М глициново-солевым буфером раствором с pH 8,2 до концентрации 0,75 мг/мл.

2. Полистироловый латекс, активированный метакрилатом цинка, с размером частиц 0,2 мкм разводят 0,05 М глициново-солевым буферным раствором с pH 8,2 до концентрации 1% в расчете на полимер.

3. Полистироловый карбоксилированный латекс с размером частиц 1,2 мкм разводят 0,05 М глициново-солевым буферным раствором с pH 8,2 до концентрации 1% в расчете на полимер.

4. Подготовленные по пп. 2 и 3 полистирольные латексы берут в объемном соотношении 1 1.

5. 10 мл состава, полученного по п. 1 инкубируют с 10 мл латексной взвеси, полученной по п. 4, в водяной бане при 56^oC в течение 45 мин.

6. Смесь, полученную по п. 5, охлаждают до 4 6^oC в течение 18 20 ч, добавляют 20 мл 0,1%-ного раствора бычьего сывороточного альбумина в 0,05 М глициново-солевом буферном растворе с pH 8,2, содержащего 12% полиэтиленгликоля-6000. В полученную смесь добавляют 0,004 г мертиолята (консерванта).

В результате проведенных операций получен препарат для индикации возбудителя коклюша в жидкой питательной среде.

Препарат, изготовленный вышеописанным способом, обладает высокой специфичностью, проявляющейся в отсутствии перекрестных реакций в отношении другой микрофлоры верхних дыхательных путей. Чувствительность препарата в реакции латексной агглютинации (РЛА) на стекле с культурой возбудителя коклюша 60 100 млн. микробных тел в 1 мл по стандарту мутности ГИСК им. Тарасевича.

Препарат с подобной чувствительностью позволяет констатировать наличие Bordetella pertusis в жидкой питательной среде через 1 сут роста культуры (без выращивания ее на твердой питательной среде), тем самым сокращая время анализа с 5 7 сут до 1 2 дн.

Использование: получение препарата для индикации возбудителя коклюша в жидкой питательной среде. Сущность изобретения: способ осуществляют в 0,05 М глициново-солевом буферном растворе с pH 8,2 - 8,25 путем иммобилизации гаммаглобулина, иммунного к возбудителю коклюша, на поверхности частиц полистирольного латекса, активированного метакриловой кислотой и метакрилатом цинка. Иммобилизацию проводят в присутствии бычьего сывороточного альбумина, полиэтиленгликоля и консерванта. Используемый латекс представляет собой смесь полистирольного латекса с дисперсностью 0,20 - 0,25 мкм и 1,1 - 1,2 мкм. Компоненты для получения препарата берут в определенных весовых соотношениях.

Способ получения препарата для индикации возбудителя коклюша в жидкой питательной среде, отличающийся тем, что процесс проводят в среде глициново-солевого буферного раствора с молярностью 0,05 и pН 8,20 8,25 путем иммобилизации гаммаглобулина, иммунного к возбудителю коклюша, на частицах полистирольного латекса, причем в качестве полистирольного латекса используют смесь в равном соотношении полистирольного латекса с дисперсностью 0,2 0,25 мкм, активированного метакрилатом цинка при объемном включении, и карбоксилированного полистирольного латекса с дисперсностью 1,1 1,2 мкм, с последующей стабилизацией полученного препарата раствором бычьего сывороточного альбумина, полиэтиленгликоля 6000 и консерванта, при следующем соотношении компонентов, г на 1 л глициново-солевого буферного раствора:
Гаммаглобулин, иммунный к возбудителю коклюша 0,18 0,20
Смесь латексов 2,50 2,55
Бычий сывороточный альбумин 0,50 0,55
Полиэтиленгликоль 6000 55,0 60,0
Консервант 0,1 1,0.