СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ СТРЕПТОКОККОВ ГРУППЫ А ИЛИ ГРУППЫ С Российский патент 1998 года по МПК A61K39/00 

Способ относится к микробиологии, а именно к получению препаратов, необходимых для проведения иммунологического анализа с целью идентификации стрептококков группы А или стрептококков группы С.

Указанные препараты необходимы для: 1. выявления стрептококковой этиологии заболеваний у людей; 2. контроля за эффективностью лечения больных стрептококковыми заболеваниями; 3. оценки эффективности профилактики стрептококковых болезней.

Из аналогов известен способ получения препаратов для идентификации стрептококка группы А или стрептококка группы С, изложенный в статье журнала, издаваемого в Болгарии. (Стоянова М. Панев Н. Бързо идентифицирование на бета-хомолитични стрептококки от групита А, В, С, G с коаглутинация. Епидемиология, микробиология и инфекциозии болести. 1982.-XIX.-4.-341-346).

Получение препаратов по аналогу основано на необходимости использования в качестве носителя антител стафилококкового А-протеина, что усложняет технологию изготовления и не обеспечивает получения препарата с высокой чувствительностью.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому является способ, который описан в заявке на изобретение Японии N 63-52708, согласно которому возможно получить препараты для идентификации стрептококков группы А или группы С. Указанный способ принят авторами за прототип. По прототипу препараты получают путем иммобилизации антител гаммаглобулинов, иммунных к стрептококку группы А или к стрептококку группы С на поверхности частиц латекса, получаемого на основе полистирола, и последующего отделения обработанных латексных частиц. Прототип основан на реакции латексной агглютинации. Недостатком прототипа является сложность технологии получения препарата, заключающаяся в необходимости двукратной обработки латексных частиц составами, включающими антитела, с целью их иммобилизации.

Техническая сущность предлагаемого способа состоит в том, что целевые препараты получают путем иммобилизации гаммаглобулинов, иммунных к стрептококку группы А или к стрептококку группы С. Процесс включает следующие операции:
1. Смешение антител гаммаглобулинов, иммунных к стрептококку группы А или стрептококку группы С, разбавленных 0,01 М глициново-солевым буферным раствором с рН 8,2, с латексом, разбавленным тем же буферным раствором до содержания латекса в буферном растворе 1% в расчете на полимер. Применяемый латекс представляет собой смесь полистирольного латекса с дисперсностью 0,20-0,22 мкм и полистирольного латекса с дисперсностью 0,50-0,70 мкм, активированного метакрилатом цинка. Объемное соотношение указанных латексов в смеси равно 1:1.

2. Смесь, полученную по п.1, инкубируют при 56^oC в течение 30 мин в водяной бане.

3. Смесь, полученную по п.2, охлаждают до 4-6^oC.

4. Охлажденную смесь смешивают с бычьим сыворотным альбумином, предварительно разбавленным 0,01 М глициново-солевым буфером с рН 8,2.

5. В смесь, полученную по п.4, вводят полиэтиленгликоль ПЭГ-6000 и консервант.

6. Компоненты, необходимые для приготовления целевого препарата, берут в следующем соотношении, г/л:
Гаммаглобулин, иммунный к стрептококку группы А, или гаммаглобулин, иммунный к стрептококку группы С 0,187-0,212
Смесь латексов 2,500-2,550
Бычий сыворотный альбумин 0,500-0,600
Полиэтиленгликоль-6000 60,000-80,000
Консервант 0,100-0,120
Глициново-солевой буфер 0,01 М с рН 8,20-8,25 Остальное
Предлагаемый способ несложен и обеспечивает получение высокочувствительных препаратов.

Авторы утверждают, что способ соответствует критерию изобретательского уровня, т.к. на основании ознакомления с научно-технической и патентной информацией, а также в силу своих опыта и знаний вся совокупность технических признаков заявляемого способа явным образом не вытекает из уровня техники, имеющей отношение к заявляемому объекту.

Способ осуществляют следующим образом.

1. Гаммаглобулин, иммунный к стрептококкам группы А, или гаммаглобулин, иммунный к стрептококкам группы С, разводят 0,01 М глициновым солевым буферным раствором с рН 8,20 до концентрации 0,8 мг/мм.

2. Полистирольный латекс с размером частиц 0,2 мкм разводят 0,01 М глициново-солевым буферным раствором с рН 8,20 до концентрации 1% полимера.

3. Полистирольный латекс с размером частиц 0,60 мкм, активированный метакрилатом цинка, разводят 0,01 М глициново-солевым буфером с рН 8,2 до концентрации 1% полимера.

4. Подготовленные по пп.2 и 3 полистирольные латексы смешивают в объемном соотношении 1:1.

5. 10 мл состава, полученного по п.1, смешивают с 10 мл латексной смеси, полученной по п.4.

6. Смесь, полученную по п.5, инкубируют на водяной бане при 56^oC при 140 колебаниях в 1 мин в течение 30 мин.

7. Смесь, полученную по п.6, охлаждают до 4-8^oC. К охлажденной смеси добавляют 20 мл 0,1%-ного раствора бычьего сывороточного альбумина в глициново-солевом буферном растворе 0,01 М с рН 8,2, содержащего 6% полиэтиленгликоля-6000. В полученную смесь добавляют 0,004 г мартиолята (консерванта).

В результате проведенных операций получают препараты для идентификации стрептококка группы А или стрептококка группы С.

Препараты, изготовленные вышеописанным способом, обладают высокой специфичностью, проявляющейся в отсутствии перекрестных реакций в отношении антигенов гетерологичных групп этих микроорганизмов.

Результаты исследования чувствительности полученных препаратов и реакции латексной агглютинации (РЛА) представлены ниже по следующим тестам:
1. РЛА на стекле с культурами, обработанными химопсином, - 10⁴-10⁵ КОЕ.

2. РЛА на стекле с групповыми полисахаридами, экстрагированными из культур стрептококков, взятых путем мазка 10⁴ КОЕ.

3. РЛА на стекле с экстрактами группового полисахарида из отдельных колоний 1 колония.

4. РЛА на стекле с очищенным групповым полисахаридом 2,0 4,0.

Примечание:
1. КОЕ колониеобразующие единицы стрептококка.

2. Чувствительность препаратов представлена в соответствующих показателях, содержащихся в одной пробе испытуемого материала (0,05 мл).

Использование: в медицине, в частности, в миробиологии. Сущность: препараты получают следующим образом - гаммаглобулин, иммунный к стрептококку группы А, или гаммаглобулин, иммунный к стрептококку группы С, иммобилизируют на поверхности частиц полистирольного латекса. Полистирольный латекс представляет собой смесь полистирольного латекса с дисперсностью 0,20-0,22 мкм и полистирольного латекса с дисперсностью 0,50-0,70 мкм, активированного метакрилатом цинка. Стабилизируют препарат в присутствии бычьего сыворотного альбумина, а также вводят в состав препарата полиэтиленгликоль и консервант. Способ осуществляют при условии определенного соотношения используемых компонентов, приведенных в г/л. Процесс проводят в 0,01 М глициново-солевом буферном растворе с рН 8,20-8,22. Способ прост в использовании.

Способ получения препаратов для идентификации стрептококков группы A или группы C, отличающийся тем, что гамма-глобулин, иммунный к стрептококку группы A, или гамма-глобулин, иммунный к стрептококку группы C, иммобилизуют на поверхности частиц полистирольного латекса и полученный препарат стабилизируют раствором бычьего сывороточного альбумина в присутствии полиэтиленгликоля и мертиолята, причем в качестве полистирольного латекса используют смесь, составленную из равных объемов полистирольного латекса с дисперсностью 0,20 0,22 мкм и полистирольного латекса с дисперсностью 0,50 0,70 мкм, активированного метакрилатом цинка и процесс проводят в 0,01 М глициново-солевом буферном растворе с pH 8,20 8,22 при следующем соотношении компонентов, г на 1 л буферного раствора:
Гамма-глобулин, иммунный к стрептококку группы A или C 0,19 0,21
Смесь полистирольных латексов 2,50 2,55
Бычий сывороточный альбумин 0,50 0,55
Полиэтиленгликоль 55,0 65,0
Мертиолят 0,10 0,12