Способ получения реагента для проведения реакции агглютинации Советский патент 1988 года по МПК A61K39/00 

Nliili

СО

Изобретение касается медицины. .в частности иммунохимических peai е; .-- тов. Цель изобретения - повьшение чувствительности реагента. Для этого частицы носителя, составляющие часть реагента, размером 0,052-1,2 ьжм сен сибилизируют антигеном или антителом. Частицы носителя, сенсибилизированные антигеном или антителом, перед суспен- дированием в водной среде обрабатьша- ют стабилизатором, включающим аминокислоты, белки, полипептиды, не осаждающиеся в иммунологической реакции агглютинации. Водная среда с рН 5-10, в которой суспендируют носитель, имеет электропроводность 5,0 мс/см и . меньше и конечную концентрацию частиц 0,01-20%. 1 табл. о 9

а о ю

Изобретение относится к иммунохими- ческому реагенту , и может быть использовано в медицине, биохимии, гигиене и эпидемиологии при анализе следовых количеств соединений, особенно антигенов и антител.

Цель изобретения - повышение чувствительности реагента.

Способ осуществляется следующим |Q образом.

Частицы носителя, которые составляют часть реагента по данному изоб- ретению, представляют собой частицы практически нерастворимые в водной jj среде. Такие частицы носителя могут быть изготовлены из любого подходящего соединения, которое включает в себя латексы таких полимерных соединений, как полистирол, бутадиенсти- 20 рольный сополимер, полиакрилат, полиме- такрилат, сополимер акрилонитрила с бутадиеном и стиролом, латексы этих полимеров, активированные введением карбоксильных или анидных групп с помощью со- 25 полимеризации с акриловой кислотой,ме- такрнповой кислотой, акриламидом и т.п. клетки крови, такие бактерии, как стафилококки и стрептококки, serra- tue marcescens, риккетсии, а также JQ части этих бактерий.

Средний диаметр частиц носителей равен от 0,05 до J,2 мкм или от 0,1 до 1,00 мкм, предпочтительно от 0,2 до 0,8 мкм. Если диаметр частиц носите- ля слишком велик,то пределы анализа сужаются или становятся более нестабильными. С другой стороны, частицы носителя с малым диаметром приводят к экономическим потерям при получении реагента и имеют низкую чувствительность. Следовательно, частицы как с Чрезмерно большим, так и с чрезмерно малыми р. диаметрами использовать не следует.45

Антигены, наносимые на частицы носителя реагента по данному изобретению включают в себя, например, белки, полипептиды, стероиды, полисахариды, липиды, пыльцу, пыль, гаптены и т.п. Антитела включают в себя, например, белки, получаемые реакцией с указан- ными айтигенами.

Концентрация частиц носителя обычно равна 0,03-0,3%, предпочтительно 0,05-0,2% (конечная концентрацрш). При более высокой концентрации частиц носителя необходимо использовать более сложное.оборудование для проведе55

Q

j 0 5 Q

5

5

ния анализа с реагентом по данному изобретению, причем дальнейшее увеличение эффективности не достигается. При низких концентрациях частиц не получают удовлетворительную чувствительность и реакционную способность.

Частицы носителя можно сенсибилизировать антигеном или антителом по любой известной методике, т.е. физической адсорбцией антигена или антитела на частицах носителя, химическим связующим антигена или антитела с частицами носителя либо комбинацией этих способов.

Количество антигена или антитела для сенсибилизации носителя выбирают в зависимости от конкретного типа антигена или антитела и нужной точности анализа с помощью данного реагента.

Частицы носителя, сенсибилизированные антигеном или антителом, перед суспендированием в водной среде могут быть обработаны стабилизатором,включающим в себя аминокислоты, полипептиды, белки и т.п., которые не осаждаются в данной иммунологической реакции, причем в качестве стабилизатора предпочтительно использовать сывороточный альбумин. Обработку стабилизатором предпочтительно проводить известным способом, с точки зрения хранения и стабильности реакции. Особенно значительный эффект достигается в тех случаях, когда антиген или антитело физически адсорбированы на носителе.

Водная среда, в которой суспендирован носитель, сенсибилизированный антигеном или антителом, должна иметь электропроводность, равную 5,0 или 2,5 мс/см, предпочтительно 1,0 мс/см и ниже. При электропроводности, пре- вьщ ающей 5,0 мс/см, реагент нестабильный, что приводит к снижению точности анализа.

Водная среда может представлять собой воду, буферный раствор и т.п. и содержать одну или более добавку, выбранную из стабилизаторов, консервантов, хелатных агентов, поверхностно- активных соединений и т.д. Буферные растворы включают в себя глициновые буферы, буферы на основе фосфорной кислоты, цитратные буферы, барбитало- вые буферы, боратные буферы, буферы на основе системы трис(трис)гидрокси- метил(анинометан)-соляная кислота, трис-малатные буферы, аммонийные буферы и т.п.

Стабилизаторы включают в себя, например, указанные стабилизаторы в концентрациях 0,001-1%, предпочтительно 0,05-0,6%.

Предлагаемые консерванты включают в себя мертиолат и азид натрия.

В качестве хелатных агентов используют этилен-диаминтетрауксусную кислоту, НИТрИЛТрИуКСуСНуЮ кислоту, ЦИК ЛО-

гександиаминтетрауксусную кислоту и т.п., в качестве поверхностно-активных соединений - неионогенные поверхностно-активные соединения.

рН водной среды равен 5-10 или 6-9,5, предпочтительно 6,5-8,5. Если рН водной среды меньше чем 5, то реагент нестабильный, хотя чувствительность повышается. Водная среда, имеющая значение рН,более 10, приводит к снижению чувствительности и в некоторых случаях к нестабильности хранения реагента.

Частицы носителя, сенсибилизированные антигеном или антителом, суспен- дируют в водной среде в концентрации 0,01-20%, предпочтительно 0,05-10%. При более низкой или более высокой концентрациях результирующий реагент имеет.пониженную стабильность, его использование становится неудобным и ограниченным,

Предлагаемый реагент получают сенсибилизацией описанных частиц носителя антигеном и антителом известным способом с последующей обработкой сен сибилизированного носителя стабилизатором и суспендированием носителя в водной среде известным способом.

Реагент по данному изобретению при годен в качестве реагента или основного раствора реагента для проведения реакции на стеклянной пластинке или в испытательной пробирке с визуальньгм наблюдением за агглютинацией или при проведении реакции в оптической кювете с оптическим контролем за ходом реакции.

Реагент может быть использован для анализа иммунологической реакции. Для этого предлагаемый реагент разбавляют буферным раствором и доводят концентрацию носителя, сенсибилизированного антигеном или антителом, до уровня, пригодного для анализа имму- нологической реакции.

Концентрация реагента зависит от вида анализируемого антитела или антигена, их концентрации и реакцион

5 о

0 5

0 5

5

ной способности, что определяется экспериментально. В случае оптического изменения иммунологической реакции конечная концентрация носителя равна не менее 0,03 вес.% или от 0,05 до 1 вес.% и более, предпочтительно 0,1-0,5 вес.%.

В случае визуального наблюдения иммунологической реакции результирующая концентрация лежит в интервале от 0,05 до 0,8 вес.%, предпочтительно от О, до 0,5 вес.%.

Буферные растворы, которые можно использовать для разбавления реагента, включают в себя глициновые буферы, боратные буферы, буферы трис- хлористоводородная кислота, трис-ма- латные буферы, аммонийные буферы и т.п.

рН используемых буферных растворов 7,6-9,6, предпочтительно.8,0-9,0. Буферный раствор с более низкими значениями рН вызьшает агглютинацию и, следовательно, делает реагент непригодным, хотя и приводит к повышению чувствительности. При более высоких значениях рН снижается чувствительность и могут нарушаться свойства при хранении при повышенных температурах, что нежелательно.

Таким образом, при визуальном наблюдении иммунологической реакции заданное количество реагентов и образца, содержащего антиген или антитело, смешивают на стеклянной пластинке или в испытательной пробирке и наблюдают агглютинацию сенсибилизированных частиц.

В случае оптического измерения иммунологической реакции заданное количество реагента и образца, содержащего антиген или антитело, смешивают и определяют в оптической кювете изменение светопропускания, светорассеяния или помутнения.

Если оптическое измерение проводят определением светопропускания, то обычно используют свет с длиной волны, большей чем средний диаметр частиц носителя, с соотношением длины волны к диаметру частиц, равным не менее 1,1 или не менее 1,5 и предпочтительно не менее 2. Длина волны обычно лежит в интервале от 600 до 2400 нм, предпочтительно от 800 до 1800 нм. Если свет имеет меньшую длину , то для получения подходящего светопропускания необходимо использовать частицы носителя з достаточно низкой концентрации, а также реагент, имеющий крайне высокую диспергируемость, что приводит к трудности увеличения чувствительности и в некоторых случаях к обратимому протеканию реакции. Большая длина волны также нежелательна из-за снижения чувствительности. Свет может быть как монохроматическим, так IQ и полихроматическим. Оптическая кювета, используемая для измерения свето- , пропускания имеет толщину от 0,2 до 10 мм

Измерение пропускания можно прово- -ig дить определением времени, требуемого для достижения заданного значения поглощения, либо определением повышения поглощения за определенный промежуток времени,7о

Оптическое измерение с использованием светорассеяния проводят, как при определении светопропускания.

Предлагаемые реагенты представляют 25 собой сенсибилизированные частицы реагента для использования в иммунологических реакциях, С их помощью можно определять количества антигена или антитела в различных образцах с хоро- 30 шей воспроизводимостью и высокой точностью. Кроме того, они эффективны после замораживания и размораживания и, следовательно, могут быть лиофили- зованы и использованы повторно, . 5

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример «Глобулиновое антитело, против с -фетопротеина растворяют в Ofi М глициновом буфере (рН 8,3). ло глобулиновых антител соответствует 800-1500 на каждую латексную частицу (имеющую диаметр О,052 мкм, производство фирмы Dow Chemical), Затем раствор смешивают с равным объемом латекс-- глицинового буфера (рН 8,8 при переешивании и комнатной температуре для остижения адекватной сенсибилизации)„ После разделения центрифугированием супернатант удаляют и осадок обрабаты-gg вают соответствующим количеством бычьего сывороточного альбумина, Получен- ыв таким образом сенсибилизированные астицы суспендируют в буферном раст- оре с концентрацией частиц 1,0%, HMe-gg щем электропроводность i,5 мс/см и одержащем соответствующее количество онсерванта, после чего суспензию оставляют на хранение, С результирующим

реагентом достигается отличная точность анализа.

Для анализа иммунологической реак ции реагент разбавляют глициновым буфером (рН 8,6).,

Результаты анализа представлены в таблице.

Примечание. Значения в скобках получены радиоиммунным анализом,

П р и м е р 2, Антитело анти-СРБ (С-реакционноспособного белка) растворяют в 0,2 М боратном буфере (рН 8,8) и латексные частицы (диаметр 0,220 мкм, производство Dow Chemical) суспендированные в таком буфере, сенсибилизируют результирующим раствором таким образом, чтобы каждая частица несла на себе 800-1800 антигенов , Сенсибилизированные латексные частицы обрабатывают бычьим сывороточным альбумином и суспендируют в соответствующем количестве боратного буфера (4,0 мс/см) с концентрацией частиц 2,0%. Результирующий реагент обладает очень высокой точностью измерения.

Пример 3. Антитело F (аЬ )2 ю крысы или козы против человеческого фибриногена растворяют в О,1 М трис- малатном буфере (рН 8,6), а латексные частицы (диаметром 1,091 мкм, производство Dow Chemical), суспендиро- is ванные в таком же буфере, сенсибилизируют результирующим раствором, чтобы чувствительность результирующего реагента бьша равна величине порядка

раствор, иcпoльзye iьiй для конечного суспендирования сенсибилизированных частиц, имеет проводимость, равную приблизительно 0,5-0,8 мс/см,

П р и м е р 6, Латексные частицы сенсибилизируют высокоочищенным крысиным антителом против человеческого

IgM в глициновом буфере с рН 9,6. Количественные соотношения изменяют в зависимости от качества антител и от нужной чувствительности. Сенсибилизированные частицы обрабатывают соот- ветстветствующим количеством бычьего сывороточного альбумина, а затем суспендируют в водном растворе, имеющем проводимость, равную приблизительно

1,2 мс/см, который может содержать приблизительно 0,05% бычьего сыворо100 нг/мл. Затем частицы обрабатывают 20 точного альбумина, в результате чего бычьин сывороточным альбумином и сус- получают целевой реагент с концентра- пендируют в водном растворе, содержащем 0,1% азида натрия (1,0 мс/см) при концентрации частиц 0,01%, При использовании реагент разбавляют трис-ма- 25 латным буфером (рН 8,4) или буфером трис-хлористоводородная кислота (рН 8,4) до нужной концентрации латекса и npoBOj HT реакцию на стеклянной пластинке либо реагент может использовать-30 ся без разбавления для оптического анализа. При реакции на стеклянной пластинке с использованием этого реагента различают агглютинирующую и неагглютинирующзпо системы.gg

Пример4, Глобулиновов антитело козы против человеческого растворяют в 0,1 М трис-малатном буфере (рН 8,8) и раствором сенсибилизируют латексные частицы (диаметром 0,312 мкм,40 получают в условиях примера 7, за производство Dow Chemical),суспен- исключением того, что используют анти- дированные в таком же буфере. Сенси- человеческое igg-антитело f(ab ).j и

цией частиц 2,5%.

Пример. Высокоочищенное крысиное антитело F (ab )i против hCG растворяют в 0,2 М трвс-НС1 буфере (рН 8,6) и результирующий раствор используют для сенсибилизации в нем ла- тексных частиц (диаметром 0,220 мкм, производство Dow Chemical), суспендированных в таком же буфере, при комнатной температуре. После обработки соответствующим количеством бычьего сывороточного альбумина сенсибилизированные частицы суспендируют в водном растворе, имеющем проводимость, равную приблизительно 0,8 мс/см, и концентрацию частиц 1%, и затем оставляют на хранение,

П р и М е р 8. Латексный реагент

латексные частицы, имеющие диаметр 0,089 мкм (производство Dow Chemica 45 Концентрация латекса равна 0,25%, Ре зультирующий реагент показывает хоро шую точность анализа,

П р и М е р 9, Латексный реагент получают в условиях примера 7 за ис

билизированные частицы обрабатывают затем бычьим сывороточным альбумином и в конце суспендируют в водном растворе с концентрацией частиц 2%, имеющем проводимость, равную приблизительно 3,0 мс/см. При использовании суспензию разбавляют 0,J М трис-малатным или трис-НС буфером до требуемой 50 лечением того, что используют антиконцентрации или используют сам по себе.

П р и М е р 5. Крысиное антитело F (ab ) 2 против человеческого IgA растворяют в 0,2 М боратном буфере (рК 8,3), раствор обрабатывают также,

как в примере 4, и получают целевой реагент в суспензии с концентрацией 1% за исключением того, что водный

сеа (канцероэнбиотический антиген) титело f (ab ) и латексные частиц. имеющие диаметр 0,8 мкм (производст Dow Chemical), Концентрация латекса 55 равна 1%, Результирующий реагент по зьшает хорошую точность анализа,

Пример 0, Латексный реаген для анализа в(-фетйпротеина получаю по методике, описанной в примере J,

раствор, иcпoльзye iьiй для конечного суспендирования сенсибилизированных частиц, имеет проводимость, равную приблизительно 0,5-0,8 мс/см,

П р и м е р 6, Латексные частицы сенсибилизируют высокоочищенным крысиным антителом против человеческого

IgM в глициновом буфере с рН 9,6. Количественные соотношения изменяют в зависимости от качества антител и от нужной чувствительности. Сенсибилизированные частицы обрабатывают соот- ветстветствующим количеством бычьего сывороточного альбумина, а затем суспендируют в водном растворе, имеющем проводимость, равную приблизительно

1,2 мс/см, который может содержать приблизительно 0,05% бычьего сывороточного альбумина, в результате чего получают целевой реагент с концентра-

получают в условиях примера 7, за исключением того, что используют анти человеческое igg-антитело f(ab ).j и

цией частиц 2,5%.

Пример. Высокоочищенное крысиное антитело F (ab )i против hCG растворяют в 0,2 М трвс-НС1 буфере (рН 8,6) и результирующий раствор используют для сенсибилизации в нем ла- тексных частиц (диаметром 0,220 мкм, производство Dow Chemical), суспендированных в таком же буфере, при комнатной температуре. После обработки соответствующим количеством бычьего сывороточного альбумина сенсибилизированные частицы суспендируют в водном растворе, имеющем проводимость, равную приблизительно 0,8 мс/см, и концентрацию частиц 1%, и затем оставляют на хранение,

П р и М е р 8. Латексный реагент

латексные частицы, имеющие диаметр 0,089 мкм (производство Dow Chemical), 45 Концентрация латекса равна 0,25%, Результирующий реагент показывает хорошую точность анализа,

П р и М е р 9, Латексный реагент получают в условиях примера 7 за исклечением того, что используют антисеа (канцероэнбиотический антиген) антитело f (ab ) и латексные частиц., имеющие диаметр 0,8 мкм (производство Dow Chemical), Концентрация латекса равна 1%, Результирующий реагент пока-- зьшает хорошую точность анализа,

Пример 0, Латексный реагент для анализа в(-фетйпротеина получают по методике, описанной в примере J,

за исключением того, что электропроводность доводят до 5 мОм/см, Результирующий реагент показывает хорошую точность анализа.

Пример 1J, Повторяют методику примера I с использованием частиц латекса размером 1,20 мкм. Реагент показывает высокую точность измерений,

Пример 2. Повторяют методику использованную в примере 2, с использованием буферной среды, электропроводность которой составляла 2,5 /см, Реагент показывает высокую точность измерений,

Таким образоМр предлагаемый реагент обладает высокой чувствительностью при обнаружении антигенов и антител, приближаясь по чувствительности к радиоиммунному анализу.

Формула изобретения

Способ получения реагента для проведения реакции агглютинации, включающий сенсибилизацию частиц носителя антигеном или антителом, и суспендиро- ванне в водной среде, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности реагента, для сенсибилизации используют частицы носителя размером 0,052-1,2 мкм и сус- пендирование осуществляют в среде с электропроводностью 5,0 мс/см и меньше и с концентрацией частиц 0,01- 20%.