СОСТАВ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ РАСТЕНИЙ СЕМЕЙСТВА РЯСКОВЫЕ (WOLFFIA ARRHIZA) В УСЛОВИЯХ IN VITRO Российский патент 2013 года по МПК A01G31/00 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для производства как высокобелковых кормов в отраслях кормопроизводства, так и разнообразных белковых препаратов в фармацевтике и ветеринарии.

При культивировании растений семейства рясковых (разные виды Lemna, Wolffia, Spirodela) в условиях in vitro рядом исследователей рекомендованы среды, составленные по прописям Мурасиге-Скуга (наиболее универсальная среда) (Воинов Н.А. и др. 2009), Гамборга, Шенка-Хильдебрандта (Schenk and Hildebrandt, 1972; Gamborg et al., 1968; Boehm et al., 2001; Kruse et al., 2001; Li J. et al., 2004; Friedrich A.S., 2005).

Наиболее распространенными средами для водных и песчаных культур являются среды, составленные по прописям Кнопа, Стейнберга и Хогланда-Арнона (Гродзинский А.М., Гродзинский Д.М., 1973; Steinberg, R., 1946; Knop, 1865; Hoagland and Arnon., 1938) и имеющие более низкое, по сравнению с вышеупомянутыми, содержание минеральных веществ. Все указанные среды разработаны для культивирования широкого круга растений, поэтому не в полной мере удовлетворяют индивидуальным потребностям в элементах питания отдельно взятого объекта, что не позволяет максимально реализовать его потенциальную биологическую продуктивность.

Наиболее близкими по биологической сущности к изобретению являются среда Хогланда-Арнона (Гродзинский А.М., Гродзинский Д.М., 1973; Hoagland and Arnon., 1938), включающая в свой состав следующие компоненты, мас.%:

KН₂РO₄ 0,45 Ca(NO₃)₂×4Н₂O 3,60 KNO₃ 1,67 MgSO₄×7H₂O 1,63 FeCl₃×6H₂O 6,42 Nа₂ЭДТА×2Н₂O 19,89 Na₂MoO₄×2H₂O 0,0003 ZnSO₄×7H₂O 0,0007 CuSO₄×5H₂O 0,0003 MnCl₂×4H₂O 0,006 H₃BO₃ 0,009 Сахароза Остальное

К недостаткам указанной среды для культивирования водных растений относятся: несбалансированность минерального питания для индивидуальных потребностей Wolffia arrhiza и практически полное отсутствие органических элементов питания за исключением сахарозы.

Задача изобретения - повышение биологической продуктивности Wolffia arrhiza за счет оптимизации содержания элементов питания в культивационной среде.

Поставленная задача достигается изменением баланса минеральных элементов в питательном растворе, заменой некоторых минеральных элементов и включением в раствор дополнительных как минеральных, так и органических компонентов. Для этого среда, включающая фосфат калия монозамещенный - KН₂РO₄, четырехводный нитрат кальция - Ca(NO₃)₂×4Н₂O, нитрат калия - KNO₃, семиводный сульфат магния - MgSO₄×7H₂O, двуводный молибдат натрия - Na₂MoO₄×2H₂O, семиводный сульфат цинка - ZnSO₄×7H₂O, двунатриевый дигидрат этилендиаминтетрауксусной кислоты - Na₂ЭДТА×2Н₂O, пятиводный сульфат меди - CuSO₄×5H₂O и борную кислоту - Н₃ВO₃, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит калия йодид -KI, шестиводный хлорид кобальта - СоСl₂×6Н₂O, аспарагин, глутамин, тиамин, пиридоксин, аскорбиновую кислоту, мезоинозит, семиводный сульфат железа - FeSO₄×7H₂O и пятиводный сульфат марганца - MnSO₄×5H₂O, при следующем содержании компонентов, мас.%:

KН₂РO₄ 1,044-1,050 Ca(NO₃)₂×4Н₂O 3,90-4,00 KNO₃ 1,60-1,68 MgSO₄×7H₂O 1,20-1,26 FeSO₄×7H₂O 0,040-0,046 Na₂ЭДТА×2H₂O 0,059-0,067 KI 0,0035-0,0051 Na₂MoO₄×2H₂O 0,00048-0,00060 ZnSO₄×7H₂O 0,00012-0,00022 CuSO₄×5H₂O 0,00014-0,00022 MnSO₄×5H₂O 0,0023-0,0027 H₃BO₃ 0,011-0,017 СоСl₂×6H₂O 0,00060-0,00084 Аспарагин 0,22-0,28 Глутамин 0,35-0,45 Тиамин 0,0010-0,0016 Пиридоксин 0,009-0,017 Аскорбиновая кислота 0,041-0,049 Мезоинозит 1,31-1,39 Сахароза Остальное

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что заявляемый состав раствора отличается от известных по содержанию всех компонентов, ионной формой ряда компонентов и введением новых компонентов. Таким образом, заявляемое решение соответствует критерию «новизна». Разработанная среда обеспечила многократное повышение продуктивности Wolffia arrhiza по целому комплексу показателей, таких как: прирост биомассы популяции, содержание тотального белка в 100 мг сырой массы и процентное содержание белка в сухой массе, обеспечивая при этом достаточно высокий показатель содержания сухого вещества, и не вызывая видимых физиологических отклонений в архитектонике растения. Наиболее важный показатель - выход тотального белка с популяции - также превосходит аналогичный показатель при культивировании Wolffia arrhiza на ранее известных аналогах сред. Таким образом, данный состав компонентов среды действительно увеличивает продуктивность объекта, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого решения критерию «существенные отличия».

Для экспериментальной проверки заявляемого состава были подготовлены 4 варианта: прототип (среда Хогланда-Арнона (Hg)) и 3 варианта заявляемой среды (W3M«1» - среда составлена по наименьшей границе заявляемых допустимых интервалов масс компонентов, W3M«2» - среда составлена по средним величинам из заявляемых допустимых интервалов масс компонентов, W3M«3» - среда составлена по наибольшей границе заявляемых допустимых интервалов масс компонентов).

Смеси получили простым смешиванием. Среды готовили из концентрированных маточных растворов стандартной компоновки (Шевелуха B.C., 1998):

Раствор Методика приготовления раствора Количество раствора в мл/л среды W3M«1» W3M«2» W3M«3» Раствор четырехводного нитрата кальция В 80 мл дистиллированной воды добавляют 23,6 г Ca(NO₃)₂×4Н₂O. Полученный раствор доводят дистиллированной водой до кондиционного объема в 100 мл 3,63 3,7 0 3,77 Раствор макроэлементов В 400 мл дистиллированной воды добавляют: 18,2 20,0 21,8 KNO₃ 9,2 г MgSO₄×7H₂O 6,7 г KН₂РO₄ 5,8 г Полученный раствор доводят дистиллированной водой до кондиционного объема в 500 мл Раствор микроэлементов В 100 мл дистиллированной воды добавляют: 0,9 1,0 1,1 MnSO₄×7H₂O 0,18 г Н₃ВО₃ 0,31 г ZnSO₄×7H₂O 0,037 г KI 0,096 г CuSO₄×5H₂O 0,0038 г Na₂MoO₄×2H₂O 0,012 г СоСl₂×6Н₂O 0,016 г Раствор хелата железа 1. Растворяют в 400 мл дистиллированной воды: 2,8 г FeSO₄×7H₂O. 1,77 1,95 2,13 2. Растворяют в 100 мл дистиллированной воды: 3,73 г Na₂ЭДТА×2H₂O. 3. Оба раствора смешивают и нагревают на водяной бане до константного состояния смеси. Раствор органических веществ В 100 мл дистиллированной воды добавляют: 0,9 1,0 1,1 Тиамин 0,03 г Пиридоксин 0,3 г Аскорбиновая кислота 1,0 г Вещества, добавляемые в виде сухих препаратов Количество вещества в г/л среды Мезоинозит 0,29 0,3 0,31 Глутамин 0,0782 0,0894 0,1006 Аспарагин 0,0488 0,0555 0,0622 Сахароза 20,06 20,0 19,94

Растения помещали на жидкие питательные среды в количестве 100 растений в одну колбу общим объемом 500 мл в трехкратной повторности для каждого из вариантов. Объем среды в каждой колбе составлял 300 мл, культивацию осуществляли на шейкере при 90 об/мин. Учетный период - 1 месяц со дня посадки.

Среда Биомасса популяции в г Масса тотального белка в мкг/100 мг сырой массы Масса белка популяции в мг Содержание сухого вещества в % Белка в сухом веществе в % W3M «1» 11,72 1471,22 170,89 4,5 32,9 W3M «2» 19,05 1813,20 392,15 4,9 40,1 W3M «3» 13,48 1435,65 193,14 4,6 31,6 Hg 6,99 846,13 58,97 3,9 22,1

Приведенные в таблице данные по результатам дисперсионного анализа показали наличие достоверных различий фактора на 95% уровне значимости.

Из таблицы следует, что заявляемая среда существенно превосходит по всем показателям продуктивности прототип. Также полученные данные свидетельствуют о том, что при использовании граничных значений заявляемых допустимых интервалов масс компонентов происходит снижение продуктивности Wolffia arrhiza по всем показателям в связи с дефицитом либо избытком элементов питания в среде.

Источники информации

1. Воинов Н.А., Волова Т.Г., Зобова Н.В., Маркова С.В., Франк Л.А., Шишацкая Е.И. Современные проблемы и методы биотехнологии / Учеб. пособие. - Красноярск, ИПК СФУ, 2009. - 418 с.

2. Гродзинский А.М., Гродзинский Д.М. (1973). Краткий справочник по физиологии растений. Изд 2, испр., доп. - Киев: Наукова думка. - 590 с.

3. Сельскохозяйственная биотехнология / В.С. Шевелуха, С.В. Калашникова, Е.З. Кочиева [и др.]. - М.: Высш. шк., 1998. - 416 с.

4. Boehm R., Kruse С., Voeste D., Barth S. and Schnabl H. (2001) A transient transformation system for duckweed (Wolffia columbiana) using Agrobacterium-mediated gene transfer. J Appl Bot 75:107-111.

5. Friedrich A.S. (2005). Untersuchungen zu Kultivierung, Transformation und Fermentation von Wolffia spec. - Inaugural - Dissertation. - 177 s.

6. Gamborg O.L., Miller R.A. and Ojima K. (1968). Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Experimental Cell Research 50, 151-158.

7. Gamborg O.L., Constabel F., La Rue, T.A.G., Miller R.A. & Steck W. (1971). The influence of hormones on secondary metabolite formation in plant cell cultures. In Les Cultures de Tissas de Plantes, pp.335-44. Paris: Centre National de la Recherche Scientifique.

8. Hoagland D.R. and Arnon D.I. (1938). The water-culture method for growing plants without soil Univ. Calif. Coll. Agric. Exp. Sta. Circ. Berkeley, CA 347-353.

9. Knop W. (1865). Quantitative Utersuchungen Über den ErnährungensprozeB der Pflanze. Landw. Versuchssat. 7:93.

10. Knop W. (1865) Arbeiten aus dem Laboratorio der Versuchs-Station zu Moecern. Die Landwirtschaftlichen Versuchs-Stationen 7: 436-450.

11. Kruse C., Boehm R., Voeste D., Barth S. and Schnabl H. (2001). Transient transformation of Wolffia columbiana by particle bombardment. Aquatic Bot 72:175-181.

12. Li J., Jain M., Vunsh R., Vishnevetsky J., Hanania U., Flaishman M., Perl A., Edelman M. Callus induction and regeneration in Spirodela and Lemna // Plant Cell Rep (2004) 22:457-464.

13. Steinberg R., 1946: Mineral requirement of Lemna minor. Plant Physiology, 21, 42-48.

Изобретение относится к области сельского хозяйства и может быть использовано для культивирования растений семейства Рясковые (Wolffia arrhiza) в условиях in vitro. Состав среды для культивирования растений семейства Рясковые состоит из: фосфата калия монозамещенного, четырехводного нитрата кальция, нитрата калия, семиводного сульфасульфата цинка, двуводного молибдата натрия, семиводного сульфата цинка, двунатриевого дигитрата этилендиаминтетрауксусной кислоты, борную кислоту и сахарозу. Дополнительно состав среды содержит: калия йодид, кобальта хлорид, аспарагин, глутамин, тиамин, пиридоксин, аскорбиновую кислоту, мезоинозит, семиводный сульфат железа и пятиводный сульфат марганца. Технический результат заключается в повышении биологической продуктивности растений семейства Рясковые (Wolffia arrhiza) за счет оптимизации содержания элементов питания в культивационной среде. 1 табл.

Состав среды для культивирования растений семейства Рясковые (Wolffia arrhiza) в условиях in vitro, включающий фосфат калия монозамещенный - KH₂PO₄, четырехводный нитрат кальция - Са(NO₃)₂·4H₂O, нитрат калия - KNO₃, семиводный сульфат магния - MgSO₄·7H₂O, двуводный молибдат натрия - Na₂MoO₄·2H₂O, семиводный сульфат цинка - ZnSO₄·7H₂O, двунатриевый дигидрат этилендиаминтетрауксусной кислоты - Na₂ЭДTA·2H₂O, пятиводный сульфат меди - CuSO₄·5H₂O, борную кислоту -Н₃ВО₃ и сахарозу, отличающийся тем, что дополнительно содержит калия йодид - KJ, шестиводный кобальта хлорид - CoCl₂·6H₂O, аспарагин, глутамин, тиамин, пиридоксин, аскорбиновую кислоту, мезоинозит, семиводный сульфат железа - FeSO₄·7H₂O и пятиводный сульфат марганца - MnSO₄·5H₂O при следующем содержании компонентов, мас.%:
KH₂PO₄ 1,044-1,050 Ca(NO₃)₂·4H₂O 3,90-4,00 KNO₃ 1,60-1,68 MgSO₄·7H₂O 1,20-1,26 FeSO₄·7H₂О 0,040-0,046 Na₂ЭДTA·2H₂O 0,059-0,067 KJ 0,0035-0,0051 Na₂MoO₄·2H₂O 0,00048-0,00060 ZnSO₄·7H₂O 0,00012-0,00022 CuSO₄·5H₂O 0,00014-0,00022 MnSO₄·5H₂O 0,0023-0,0027 H₃BO₃ 0,011-0,017 CoCl₂·6H₂O 0,00060-0,00084 Аспарагин 0,22-0,28 Глутамин 0,35-0,45 Тиамин 0,0010-0,0016 Пиридоксин 0,009-0,017 Аскорбиновая кислота 0,041-0,049 Мезоинозит 1,31-1,39 Сахароза Остальное