ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS PUMILUS ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ПРОТИВ ФИТОПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ Советский патент 1995 года по МПК A01N63/00 C12N1/20 

Изобретение относится к сельскому хозяйству и касается штамма, который оказывает антагонистическое действие на фитопатогенные грибы и бактерии, и может быть использовано для защиты растений от заболеваний, вызываемых фитопатогенами.

Известен штамм Pseudomonas sp. подавляющий рост гриба Helminthosporium sativum возбудителя корневой гнили злаковых растений (авторское свидетельство СССР N 1464468, A 01 N 63/00, 1987). Однако отсутствуют сведения о действии этого штамма на другие фитопатогены.

Известен штамм Pseudomonas putida, подавляющий рост фитопатогенного гриба Fusarium oxysporum (патент США N 4714614, 424-93, 1987). Однако не описано его действие на другие фитопатогены.

Известен штамм Pseudomonas cepacia 526, активный против широкого спектра фитопатогенных грибов (патент ЕР N 0257756, A 01 N 63/00, 1987). Однако отсутствуют сведения о его действии на рост грибов Botrytis spp. Helminthosporium spp. Fusarium heterosporium, Fusarium solani, а также на фитопатогенные бактерии.

Известен штамм Pseudomonas aureofaciens, оказывающий антагонистическое действие на фитопатогенные бактерии (авторское свидетельство СССР N 1482188, C 12 N 1/20, 1987), однако спектр его антагонистического действия на фитопатогенные микроорганизмы узок.

Целью изобретения является выделение природного штамма бактерий с широким спектром антагонистического действия на фитопатогенные грибы и бактерии.

Новый штамм Bacillus pumilus ВКМ CR-333Д был выделен из почвы под виноградом в Молдавии в 1984 г. Он характеризуется следующими признаками.

Спорообразующие, грамположительные крупные палочки. Споры (окраска фуксином Циля) цилиндрические, спорангии не раздуты. Клетки хорошо растут на простых питательных средах: мясопептонном агаре (МПА), агаризованном бульоне Хоттингера, картофельном агаре. На агаре Хоттингера (при 30^оС) на 3-5 сутки образует беловатые, слабо выпуклые колонии, на МПА с суслом колонии серые, морщинистые с довольно крупными складками.

Оксидазу не образует, нитраты не восстанавливает, крахмал не гидролизует. Образует каталазу и ацетаин. Утилизирует с образованием кислоты глюкозу, арабинозу, ксилозу, маннозу, газ не образует.

В качестве источников азота клетки нового штамма используют пептон, аспарагин, аланин, тирозин, аммонийные и нитратные соли. Штамм чувствителен к антибиотикам: ампициллину (100-200 мкг/мл), стрептомицину (100-500 мкг/мл), хлорамфениколу (20 мкг/мл), тетрациклину (10 мкг/мл), канамицину (30-100 мкг/мл), налидиксовой кислоте (50-100 мкг/мл), рифампицину (50-100 мкг/мл).

Оптимальная температура роста клеток +30^оС, штамм способен к росту при 42^оС.

Штамм Bacillus pumilus ВКМ CR-333Д не вирулентен для лабораторных животных: при введении белым мышам весом 14-16 г внутрибрюшинно по 0,5 мл 1 млрд. взвеси 18-часовой культуры при наблюдении в течение 30 дней гибели животных не было.

Штамм хранится на косяках агаризованного бульона Хотингера или картофельного агара в течение 1 месяца, а также в лиофильно высушенном состоянии не менее 1 года.

Штамм идентифицирован по определителю Kried N.R. at all. "Bergey's mannal of systematic Bacteriology" Baltimore-London, 1984, v. 1.

Штамм оказывает антагонистическое действие на фитопатогенные грибы и бактерии, являющиеся возбудителями различных болезней растений.

Свойства нового штамма иллюстрируются следующими примерами.

П р и м е р 1. Для получения препарата лиофилизированных клеток штамм выращивают в течение суток на косяках агаризованного бульона Хоттингера или картофельного агара. Клетки смывают с косяков раствором следующего состава: 1 мл физиологического раствора и 1 мл смеси, приготовленной из 10 частей сыворотки крупного рогатого скота без консерванта и 1 части раствора сахарозы с концентрацией 1 г/мл. Суспензию лиофилизируют. При использовании штамма из лиофилизированной культуры готовят суспензию с титром 10⁸-10⁹ клеток на 1 мл и используют как препарат против фитопатогенных микроорганизмов.

Препарат можно приготовить и по следующей методике. Клетки нового штамма выращивают в течение суток при 30^оС на чашках с агаризованной средой следующего состава, г/л: Дрожжевой экстракт 4,0 Гидролизат казеина 8,0 K₂HPO₄ 3,0 MgSO₄ 0,3 Сахароза 10,0 Вода дистиллированная До 1 л
Клетки смывают фосфатным буфером (рН 7,2), центрифугируют и суспензируют в этом же буфере до титра 5 х 10⁹ клеток/мл. С 1 см² поверхности питательной среды получают 1-2 х 10⁹ клеток. Для выращивания бактерий можно также использовать картофельный агар, для смывания физиологический раствор или стерильную прокипяченную воду. Полученную суспензию используют как препарат против фитопатогенных микроорганизмов.

П р и м е р 2. Изучили действие нового штамма на фитопатогенные бактерии.

Клетки штамма засевали уколом на чашки с различными агаризованными средами и выращивали при 28-30^оС. Выросшие колонии убивали парами хлороформа, а на поверхность среды наносили второй слой добавляя 3 мл 0,7%-ной агаризованной среды того же состава, смешанной с 0,1 мл тесткультуры, выросшей до экспоненциальной фазы роста (1-3 х 10⁸ клеток/мл) в жидкой среде того же состава на качалке. Результаты приведены в табл. 1 и 2 и свидетельствуют о широком спектре антагонистического действия нового штамма на фитопатогенные бактерии, в том числе на 17 штаммов агробактерий нопалинового и октопинового типа, выделенных из почвы и из растений винограда. 14 изученных штаммов агробактерий проявляли онкогенное действие на растения.

П р и м е р 3. Изучено антагонистическое действием штамма на фитопатогенные грибы.

Культуру бактерий высевали сплошным "газоном" на поверхность питательного агара (МПА с 2% глицерина или среда Кинга Б) и выращивали при 28^оС в течение 2-3 суток. Затем пробочным сверлом (диаметр 8-10 мм) вырезали диски из агаризованной среды с клетками нового штамма и переносили их на поверхность другой агаризованной среды (среда Чапека или картофельный агар), предварительно засеянной глубинным способом суспензией тест-культуры гриба из расчета около 100 спор на 1 мл среды. Учет проводили по зонам отсутствия или подавления роста вокруг диска через 3-6 суток. Установлено антагонистическое действие нового штамма на фитопатогенные грибы Botrytis cinerea, Helminthosporium sativum и на отдельные виды Fusarium (радиус зон подавления соответственно 20, 10, 20 мм).

П р и м е р 4. Новый штамм использован для защиты растений гороха от бактериального рака.

Трехсуточные проростки гороха сорта "Уладовский юбилейный" декапитировали бритвой и на срез наносили каплей суспензию онкогенных штаммов агробактерий в буфере либо их суспензию в сочетании с суспензией нового штамма. Затем проростки инкубировали в темноте при 22-24^оС в кюветах с водой. Учет образования опухолей проводили на 12-15-й день после заражения. Результаты приведены в таблице 3 и свидетельствуют о том, что новый штамм защищает растения гороха от бактериального рака. Число растений, пораженных опухолями, при использовании нового штамма составляет лишь 3% в то время как без применения нового штамма испытанные штаммы агробактерий вызывают образование опухолей у 97-100% растений гороха.

П р и м е р 5. Клетки нового штамма применили для защиты растений клевера от заболевания, возбудителем которого является гриб Whetzelinia trifoliorum.

Культуру фитопатогенного гриба выращивали при 20^оС на стерильных зернах ячменя в течение 1,5 месяца. Затем зерна с культурой гриба подсушивали на фильтровальной бумаге при комнатной температуре в течение 1-1,5 часов и размалывали. Размолотые зерна вносили в почву из расчета 25 г на 1 м². Опыт проводили в двух вариантах. В каждом варианте высевали по 100 проростков клевера лугового.

В а р и а н т 1. Сначала в почву вносили суспензию клеток нового штамма, а затем размолотые зерна ячменя с тест-культурой гриба, после чего в инокулированную почву высевали проростки клевера.

В а р и а н т 2. Семена клевера лугового замачивали в течение трех дней при комнатной температуре в суспензии клеток нового штамма. Затем в почву, инокулированную тест-культурой гриба, высевали полученные в результате замачивания проростки клевера.

Учет проводили в течение 1 месяца после посева проростков.

Параллельно проведены опыты в двух контрольных вариантах.

К о н т р о л ь 1. В почву не вносили инокулированные тест-культурой фитопатогенного гриба размолотые зерна ячменя, а также не вносили препарат из клеток нового штамма. Высевали 100 проростков клевера.

К о н т р о л ь 2. В почву вносили только тест-культуру фитопатогенного гриба, но не вносили препарат из клеток нового штамма. Высевали 100 проростков клевера лугового.

Результаты опытов представлены в табл. 4 и показывают, что в контроле 2 на жестком инфекционном фоне 60% проростков гибли уже на третий день после посева, а на шестой день наблюдалась их полная гибель.

Внесение в почву препарата из клеток нового штамма позволяет сохранить на жестком провокационном фоне на третий день 60-70% а через месяц 20-30% жизнеспособных проростков клевера лугового. С учетом того, что уже на шестой день в контроле 1 (без внесения культуры фитопатогенного гриба) оставалось жизнеспособными только 50% проростков, защитное действие нового штамма на проростки клевера лугового очевидно.

Использование: сельское хозяйство, производство средств защиты растений от заболеваний, вызываемых фитопатогенами и касается нового штамма для получения вышеуказанных средств. Сущность изобретения: штамм бактерий выделен из почвы под виноградом. Депонирован в ВКМ под N CR-333Д. Препарат против фитопатогенов готовят путем выращивания штамма на агаризованной среде (г/л): дрожжевой эстракт - 4,0, гидролизат казеина - 8, однозамещенный фосфорнокислый калий - 3,0, сернокислую магнезию - 0,3, сахарозу - 10, воду - до 1 л, в течение 1 суток при 30°С, затем с агаризованной среды смывают клетки фосфатным буфером, центрифугируют и суспендируют в этом же буфере до 5×10⁹ кл/мл. 4 табл. 5 пр.

Штамм бактерий Bacillus pumilus ВКМ СР 333 Д для получения препарата против фитопатогенных микроорганизмов.