СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АТТЕНУИРОВАННЫХ ИММУНОГЕННЫХ ШТАММОВ PASTEURELLA MULTOCIDA Российский патент 1998 года по МПК C12N1/20 A61K39/102 

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к ветеринарной микробиологии и может быть использовано для получения живых вакцин из патогенных штаммов Pasteurella multocida.

Пастереллез - высококонтагиозное инфекционное заболевание, поражающее многие виды сельскохозяйственных животных с летальностью 50-80 %. Наиболее эффективным средством профилактики инфекции, вызванной Pasteurella multocida, являются живые вакцины, приготовленные на основе ослабленных или авирулентных штаммов возбудителя. Известны различные способы получения мутаций в геноме бактерий, приводящие к снижению вирулентности и сохраняющие иммуногенные свойства штаммов.

Известен способ получения стрептомицинзависимого штамма Pasteurella multocida, обладающего иммуногенными свойствами, путем отбора устойчивых к стрептомицину мутантов (Lab. Anim. Sci - 1989, - 39,3 p.229-233).

Однако используемый подход не привел к получению эффективной вакцины.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ получения иммуногенных штаммов Pasteurella multocida в результате обработки бактерий мутагеном N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуамидином (НГ) (патент США N 4999191, A 61 K 39/07).

Недостатком этого способа является вероятность возникновения реверсий т. е. мутаций, приводящих к возврату к дикому типу штамма. Это объясняется плейотропным характером мутаций, индуцируемых НГ.

Задачей изобретения является разработка более эффективного способа аттенуации патогенных штаммов Pasteurella multocida.

Задача решается тем, что аттенуация вирулентных культур достигается за счет последовательного получения в геноме Pasteurella multocida двух независимых мутаций, первая из которых возникает спонтанно и придает клеткам устойчивость к 1000 мкг/мл стрептомицина, а вторая индуцируется под воздействием 2-аминопурина, и обеспечивает повышение устойчивости к этому антибиотику до 10 000 мкг/мл и приводит к частичной стрептомицинзависимости. Каждая мутация обуславливает значительное снижение вирулентности Pasteurella multocida. В то же время наличие двух независимых мутаций создает невозможность реверсий аттенуированных штаммов к исходному состоянию вирулентности.

Пример. Исходный выделенный от павшей индюшки, высоковирулентный для мышей (LD₅₀ 10 бактерий) штамм Pasteurella multocida чувствительный к стрептомицину в концентрации 10¹⁰ кл/мл высеивают на плотную питательную среду, содержащую 100 мкг/мл стрептомицина и инкубируют при 37^oC в течение 24-40 ч. В этих условиях образуются отдельные редкие колонии с частотой 1 - 5•10^-9. Мутантные клоны, МПК стрептомицина, для которых не превышает 1000 мкг/мл, исследуют с целью оценки вирулентности для беспородных белых мышей в дозах 10⁴ - 10⁷ м. кл. путем подкожного заражения. Далее используют штаммы со сниженной не менее чем на 4 порядка вирулентностью (LD₅₀ - 5•10⁵).

С целью дальнейшего снижения вирулентности проводят отбор второго поколения Str^r мутантов. Для этого клетки отобранных штаммов инкубируют в течение 24 ч при 37^oC в жидкой среде в присутствии 2 - амминопурина (80 мкг/мл). Бактерии в концентрации 10¹⁰ кл/мл высевают не плотную среду, содержащую 10000 мкг/мл стрептомицина и инкубируют 24 ч при 37^oC. У полученных мутантов определяют вирулентность путем подкожного заражения белых мышей бактериями в концентрации 10⁵ - 10⁸ м.кл. и отбирают штаммы с максимальным ее снижением (LD₅₀ 5 - 10⁶ - 1•10⁷ м.кл.), а также характеризующиеся стабильностью сохранения приобретенных свойств.

Изучение иммуногенности полученных штаммов Pasteurella multocida проводят путем подкожного введения 10⁴ - 10⁷ клеток (иммунизация) белым мышам с последующим через 14 дн заражением исходным штаммом в дозах 10 и 100 LD₅₀. Согласно полученным данным иммунизация животных в дозах 10⁶ - 10⁷ обеспечивает защиту 90-100% животных при заражении клетками вирулентного штамма в дозе 10 LD₅₀.

Стабильность сохранения штаммами Pasteurella multocida приобретенных признаков (сниженная вирулентность, иммуногенность, устойчивость к стрептомицину) изучают путем анализа свойств после многократного пассирования (до 10 пассажей) штаммов через организм белых мышей, пересевов на плотных и жидких питательных средах (не менее 50 пересевов) сохранения в течении одного года в лиофилиированном состоянии. Согласно результатам анализа, полученные с помощью описанного выше способа аттенуированные штаммы Pasteurella multocida не утрачивает приобретенных свойств, а именно: устойчивость к стрептомицину (МПК 10 000 мкг/мл), вирулентность (LD₅₀ 5 10 м.кл.), иммуногенность (LD₅₀ 10⁴).

Использование: биотехнология, ветеринария, ветеринарная микробиология, живые вакцины из аттенуированных штаммов Pasteurella multocida. Сущность изобретения: заключается в двуступенчатом отборе спонтанных и индуцированных 2-аминопурином мутантов возбудителя Pasteurella multocida, устойчивых к стрептомицину. Получаемые аттенуированные штаммы характеризуются наличием двух независимых мутаций, первая из которых придает клеткам устойчивость к 1000 мкг/мл стрептомицина, а вторая обеспечивает повышение уровня устойчивости к этому антибиотику до 10000 мкг/мл и приводит к частичной стрептомицинзависимости. Каждая из мутаций обуславливает значительное снижение вирулентности штаммов возбудителя. В целом наличие двух независимых мутаций обеспечивает гарантию от реверсий к исходному вирулентному состоянию и характеризует надежность способа аттенуации.

Способ получения аттенуированных иммуногенных штаммов Pasteurella multocida путем посева бактериальной взвеси на питательную среду, содержащую стрептомицин, с последующим инкубированием и отбором стрептомицинустойчивых мутантов, отличающийся тем, что отбор проводят двухступенчато: вначале отбирают спонтанные мутанты с устойчивостью к 1000 мкг/мл стрептомицина, подвергают их обработке мутагеном 2-аминопурином, а затем отбирают мутанты с устойчивостью к 10000 мкг/мл стрептомицина.