Штамм бактерий SнIGеLLа SoNNeI используемый для приготовления живой вакцины против дизентерии Зонне Советский патент 1992 года по МПК A61K39/106 C12N1/20 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается получения вакцинных штаммов, которые могут быть использованы в медицине для профилактики дизентерии Зонне.

В соответствии с требованиями вакцинные штаммы должны быть высокоиммуногенными, стабильными по остаточной

вирулентности, безопасными и нести маркеры для их дифференциации от штаммов естественного происхождения.

Известны вакцинные штаммы Shigella sonnei, полученные путем селекции спонтанных авирулентных клонов.

Однако спонтанные авирулентные мутанты шиггел не отвечают таким требованиям,как генетическая охарактеризованность в связи с трудностями расшифровки их гейотипа, приводящего к утрате вирулентности, что свидетельствует об их нестабильности и небезопасности и делает невозможным повторное выделение такого типа штаммов при утрате исходным вакционным штаммом имг г/ногеннести.

Наиболее близким к предлагаемому является штамм S,sonnet I, зав1 симый от стрептомицина. Шгзмм характеризуется достаточной иммуногенностью, генетически охарактеризован, маркирован.

Недостатком стрептомицинзйвисимых штаммов является нестабильность, связанная с наличием,одного маркера, приведшего к аттенциации, небезопасность использования и необходимость добавления антибиотика в среду вь ращивания, что ограничивает применение таких вакцинных штаммов из-за возможности аллергизации организма.

Целью изобретения является штамм S.sonnei I 3359, обладающий высокой иммуногенностью, стабильным уровнем остаточной вирулентности, маркированный, безопасный для использования в качестве живой вакцины для профилактики дизентерии Зоннё, хорошо растущий на простых питательных средах.

Штамм S.sonnei 3359 получен с использованием традиционных генетико-селекцйонных приемов (путе.м обработки мутагеном i/i отбором) из иггамма S.sonnei 1,180, характер /1зую1цегося низкой частотой утраты плазмиды , варьирующей в пределах 10-10. Бактерии исходного штамма зависимы по ,котиновой кислота. Штамм S.sonnei 3359 депонирован в к&ллекции ГИСК им. Тзрасевича под Мг 192.

Отбор штамма производится путем первичной селекции зззисимых по пурину мутантов с последующим введение, в зуксотрофный клон мутации устойчивости к рифампицину. Клокы, сохранившие ппаэмтду 120МД, контролирующую ci-iHTea антигена i фазы -л инвазивную активность шиггел, характеризуются способностью прс - икать в клетки l-iela, обладают высокой иммуногенностью и несут две мутация, сообщающие бактериям потребность в урине и устойчивость к рифэмпицину, каждая которых ведет к снижению вирулентности, что определят стабильность аттенуации т безопасность таких штаммов.

Штамм Shigelia sorsnei ГИСК М 192 характеризуется следующими свойстзамм.

Морфологические признаки. Бзктери5 штамма -, грамотрицательные палочки, средние размеры на фиксированных окрашенных препаратах 2,5-3,0 х 0,5-0,7 мкм. лишены капсул и спор, неподвижны, не обладают жгутиками.

Культуральные признаки. На мясопептонном агаре (МПА), питательном агаре Дифко штамм образует круглые, гладкие колонии в S-форме. Имеются единичные колонии в R-форме (И фаза, формирующиеся с частотой 2x10 - 1x10 . На среде Эндо

клетки штамма дают образование круглых, бледно-розовых прозрачных колоний. В мясопептонном бульоне дает равномерное помутнение с легким осадком. Кипячение в течение 2 ч не влияет на мутность взвеси и

не ведет к увеличению осадка.

Физиол о го-биохимические признаки. Факультативный анаэроб. Максимальная скорость роста при 37°С и рН 6,8-7.5. Штамм ферментирует глюкозу, фруктозу.

маннозу, мальтозу, маннит. замедленнр лактозу. Декарбоксилирует орнитин. дает положительную реакцию с метиловым красным. Не ферментирует сахарозу, ксилозу. Дульцит, адонит. инозиг, глицерин, салицин, не продуцирует индол, не образует сероводорода, не гидролизует аргинин и желатину.

Антигенная структура. Характеризуется антигенной специфичностью, типичной для

шигелл Зонне фазы. Колонии в З-форме дают выраженную агглютинацию на стекле с сывороткой шиггел Зонне I фазы, свидетельствующую о сохранении бактериями собстЕбнной плазмиды 120 МД. не обусловливают реакции агглютинации с сывороткой i фазы. Колонии R-формы (II фаза), теряющие плазмиду I фазы с частотой 2x10 1x10 , агглютинируют с сывороткой II фазы и становятся чувствительными к действию

R-специфического фага Fa.

Вирулентность. Заражение в коньюнктиву глаза морской свинки в дозе 1-2x10 бактерий не приводит к развитию кератоконъюнктивита в течение 2-недельного срока наблюдения.

Заедание в сегмент перевязанной тонкой кишки кроликов 10 петлевых единиц по исходному вирулентному штамму шигелл бактерий аттенуированного мутанта

S.sonnei I 3359 дилатации не обусловливает, Уровень остаточной вирулентности, оцениваемый по способности шигелл проникать в цитоплазму клеток Hela, осуществлен при исследовании препаратов с помощью свеТОБОЙ и электронной микроскопии. Бактерии аттенуированного мутанта S.sonnei i 3359 через 6 ч инкубации проникают и обнаружиааются в 52,3 ±3,8% клеток монослоя, однако внутриклеточное их размножение

полностью блокировано и развития цитотоксйческих изменений не наблюдают.

Стабильность остаточной вирулентности (аттенуации). Стабильность остаточной вирулентности и сохранение прежнего генотипа установлено после 10-кратного пассажа бактерий через коньюктиву глаза морских свинок.

Иммуногенность. Трехкратное введение в коньюнктивальный мешок 20 морских свинок 1-2x10 клеток штамма S.sonnel I 3359 с интервалом в 3 дня с последующим через 2 недели заражением животных тем же способом 1,2x10(3LD5o) клеток вирулентного штамма S.sonnel I 1180, обеспечивает защиту 75% (15)х ивотныхот развития кератоконьюктивиТа. Иммуногенность штамма испытана также и на петлях перевязанной тонкой кишки кроликов массой 2-2,5 кг после трехкратного введения через зонд в желудрк 5x10 бактерий с интервалами в 3-4 дня и последующим заражением исходной вирулентной культурой S.sonnei I 1180 в дозе 5x10 (5 петлевых доз) через 14 дней после иммунизации в сегменты изолированных петел-ь тонкой кишки. Аттенуированный 2маркерный штамм S.sonnei I 3359 характеризуется выраженным протективным свойством, защищая 43 из 54 (80%) петель от развития энтеросорбции(подавление дилатации петли, вызываемой воспалением и продукцией энтеротоксина).

Дифференциация вакцинного штамма от штаммов естестзенного происхождения.

Штамм S.sonnei I 3359 может быть легко идентифицирован среди выделенных культур естественного происхождения по устойчивости к 100 мкг/мл рифампицина и по зависимости от пурина.

Клиническая переносимость орально вводимых бактерий вакционного штамма S.sonnei I 3359.

Безвредность и переносимость вакцинного штамма после тщательно выполненных опытов на лабораторных животных была оценена на 6 добровольцах, 3 из которых получали перорально возрастающее количество живых бактерий в дозах 2, 4 и 6x10 с 30 мл молока. За 10 мин до вакцинации давали 2 г бикарбоната натрия. 3 добровольца получили плацебо (убитые нагреванием бактерии этого же вакцинного штамма). Реактогенность и безвредность вакцины прослеживалась ежедневно в течение 2 недель постоянным контролем локальных симптомов (тенезмы) и генерализованной реакции на ЛПС О антигена (высокая температура и коллапс). Все использованные дозы переносились добровольцами без каких-либо клинических проявлений, т.е. вакцина при оральной апппикации побочным действием не обладала.

Пример 1. Исходный штамм Shigella sonnel I 1180, вирулентный по кератоконьюнктивальной пробе на морских свинках, после обработки нитрозогуанидином и пенициллинового обогащения, рассевают на чашках с минимальным агаром, содержащих и не содержащих аденина (пуриновых

0 оснований). Таким образом удается получить клоны, зависимые по пурину, среди которых отбирают стабильные мутанты с частотой обратной реверсии к пуриннезависимости, равной 1-2x10®. Суспензию

5 одномаркерного мутанта (Риг) вводят в коньюнктивальный мешок морских свинок в концентрации 2-4x10 и отбирают клоны, обусловливающие в отличие от исходного родительского штамма развитие отдаленного по времени (не ранее чем через 2-3 дня) кератоконьюнктивита. В аттенуированный одномаркерный зависимый от пурину клон вводят вторую мутацию путем высева на чашку с МПА, содержащим 100 мкг/мл ри5 фампицина, в концентрации 10 -10 и отбирают устойчивые к антибиотику мутанты. Колонии отобранных мута-нтов 3 раза рассевают на МПА с рифампицином и у стабилизированных клонов изучают частоту

0 спонтанной утраты плазмиды I фазы,

контролирующей синтез антигена I фазы и

инвазивную активность шиггел, уровень оста-точной вирулентности и Иммуногенность.

Пример 2. Способность вакцинного

5 штамма S.sonnel I 3359 к созданию местного специфического иммунитета.

Выделение и эффективность вакцинного штамма изучена при его клиническом испытании на 97 здоровых детях в возрасте от

0 2 до 17 лет.

Перед оральной аппликлацией вакцины все дети исследованы с помощью иммуноферментногоанализа(ИФА)на наличие специфических копроантител. Дети с наличием

5 копроантител к шигеллам Зонне к клиническим исследованиям не допускались. Дети принимали вакцину натощак трехкратно с возрастающим числом живых бактерий с 510x10 до 2,5-5,0x10 на 1-. 2- и 4-й день. В

0 клиническое испытание бьто включено 4 опытные и 1 контрольная группы (см. табл.1). 1-ю группу составили 13 детей в возрасте от 4-6 лет, 2-ю - 27 детей в возрасте 6-10 лет, 3-ю- 19 детей в возрасте 11-15

5 лет, 4-ю - 13 детей в возрасте 15-17 лет и 5-ю контрольную - 15 детей в возрасте 6-15 лет, получавшие плацебо.

Клиническое наблюдение показало, что при использовании выбранной схемы иммунизации непереносимых побочных реакций

не наблюдалось. Выделение вакцинного штамма из фекалий не зарегистрировано. Специфический антиген i фазы шигелл Зонне обнаруживали в копрофильтратах с помощью реакции торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА) в течение первых 4-5 дней (табл.1). Исследование динамики титров специфических копроантител с помощью ИФА показало наличие защитных титров, особенно выраженных в течение первых 2 мес (28-53 дня), с сохранением у некоторых привитых детей до 7 (210 дней ) (см. табл.2).

Штамм S.sonnel 13359 по сравнению со штаммом-прототипом, зависимым от стреп

Безвредность и клиническая переносимость вакцинного штамма S. sonnel I 3359

томицина, характеризуется высокой иммуногенностью и стабильностью, безопасен для использования, имеет двё мутации, связанные с аттенуацией, которые одновременно являются маркерами для дифференциации вакцинного штамма от штаммов естественного происхождения, не требует при его выр1ащивании добаву1ения антибиотика в питательную среду, т.е. является более технологичным.

Ф.о рмула изобретения Штамм бактерий Shigella sonnel ГИСК № 192, используемый для приготовления живой вакцины против дизентерии Зонне.

Таблица 1

Динамика образования специфических копроантител, изученная с помощью ИФА у детей, привитых вакцинным штаммом S. sonnei I 3359 (данные после третьей

вакцинной дозь)

Таблица 2

Изобретение относится к медицине, в частности к профилактике дизентерии Зон- не. Целью изобретения является штамм Shigella sonnei 13359, обладающий высокой иммуногенностью, стабильным уровнем остаточной вирулентности, маркированный, безопасный для использования в качестве живой вакцины против дизентерии Зонне, хорошо растущий на простых питательных средах. Бактерии вакционного штамма несут две мутации - зависимость по пурину и рифампицинрезистентности, связанные с аттенуацией. Наличие оптимального уровня аттенуацйи обеспечивает высокую иммуно- гбнную активность вакцинного штамма, ус- та'новленную как в опытах эффективной защиты лабораторных животных от заражения вирулентным штаммом шигелл Зонне, так и при клиническом испытании при регистрации у вакцинированных высокого титра специфических копроантител. Две мутации у бактерий (pur'/rif*^), связанные с утратой вирулентности, обеспечивают безопасность использования штамма в качестве живой вакцины и служат маркерами, позволяющими дифференцировать вакцинный штамм от штаммов шигелл Зонне естественного происхождения. 2 табл.ч^ч*'ЁVJ о00со ел