ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО-ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ КИШЕЧНОГО ИЕРСИНИОЗА И ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗА Российский патент 1998 года по МПК C12G1/04 C12N1/20 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано при диагностике кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза.

Ведущими зарубежными фирмами "Merck", "Bilife Manual" и др. выпускаются питательные среды для выделения и первичной дифференциации Yercinia enterosolitica (Yercinia Selective Agar, CIN Agar Base) на основе мясных и дрожжевых экстрактов, пептона из мяса, желчи [1-3]
Отсутствие указанных импортных сред не дает возможности проведения сравнительных исследований.

Из отечественных препаратов известны питательная среда для идентификации псевдотуберкулезного и чумного микробов по признаку ферментации углеводов и мочевины, сухая, производства НПО "Питательные среды" г. Махачкала [4] которая состоит из следующих компонентов, г/л:
Панкреатический гидролизат казеина или мяса 10,0
Натрия хлорид 3,5
Калия фосфат однозамещенный 0,9
Глюкоза 1,0
Лактоза 9,6
Мочевина 4,8
Фуксин кислый 0,09
Бромтимоловый синий 0,09
Агар микробиологический 10,0
Вода дистиллированная До 1 л
Недостатком этой среды является необходимость первичного подращивания исследуемого материала на других средах, а также невозможность дифференцировать Y. enterocolitica.

В настоящее время среда снята с производства.

Наиболее близкой к предлагаемой среде является дифференциально-диагностическая среда с бромтимоловым синим для выделения возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза (СВТС) [5] состоящая из следующих компонентов:
Сухой питательный агар 35,0 г
Медицинская желчь 20,0 мл
Глюкоза 10,0 г
Мочевина 5,0 г
Бромтимоловый синий 8 мл 1,6% спиртового раствора
Вода дистиллированная До 1 л
Недостатком этой среды является сложность в приготовлении т.к. среда лабораторного приготовления требует раздельного автоклавирования, не стандартна.

Отсутствие отечественных питательных сред для диагностики кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза вызывает нарекания со стороны практической службы здравоохранения.

Задачей изобретения является создание сухой питательной среды, обеспечивающей стабильность результатов по дифференциации, не уступающей зарубежным образцам.

Поставленная задача решается сбалансированностью компонентного состава среды, содержащей панкреатический гидролизат рыбной муки, желчь очищенную сухую, глюкозу, мочевину, хлористый натрий, бромтимоловый синий, агар, при следующем соотношении компонентов, г/л:
Панкриотический гидролизат рыбной муки 20,0-25,0
Желчь очищенная 3,0-5,0
Глюкоза 8,0-12,0
Мочевина 4,5-6,0
Натрий хлористый 5,0-6,0
Бромтимоловый синий 0,120-0,130
Агар микробиологический 10,0-12,0
Вода дистиллированная До 1 л
pH 7,8±0,1
Количественное соотношение компонентов питательной среды и ее pH обеспечивают хорошую первичную дифференциацию Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis от других энтеробактерий уже через 24 ч.

Пример 1. Для приготовления среды берут следующие навески ингредиентов, г:
Панкреатический гидролизат рыбной муки 20,0
Желчь очищенная 3,0
Глюкоза 8,0
Мочевина 4,5
Натрий хлористый 5,0
Бромтиоловый синий 0,12
Агар микробиологический 10,0
Вода дистиллированная до 1 л
pH 7,8 ± 0,1
Навески тщательно перемешивают в 1 л дистиллированной воды, нагревают до кипения и кипятят 3 5 мин. Охлаждают до 40 45^oC и разливают в чашки Петри слоем в 7-8 мм. Перед посевом подсушивают 30 мин при комнатной температуре.

Предлагаемая среда обеспечивает рост следующих тест-штаммов:
Yenteroocolitica И-27-03
Y pseudotuberculosis I
E. coli 055 K 59 3912/41
Salmonella typhimurium 79
Shigella flexneri 1a 8516
Pr. mirabilis 3177
при посеве 0,1 мл микробной смеси из разведения 10^-6 через 24 ч инкубации при (37±1)^oC.

При этом колонии Yenterocolitica круглые, голубовато-зеленого цвета, диаметром (2,0±0,5) мм, колонии Y. pseudotuberculosis - голубовато-зеленые, с фестончатым краем и темным выпуклым центром диаметром (1,5 ±0,5) мм. Колонии E. coli ярко желтые, сочные, выпуклые, диаметром (1,5±0,5) мм. Колонии Sh. flexneri желтые, сочные, плоские, диаметром (1,5±0,5) мм. Колонии Pr. mirabilis нежно голубого цвета, с темным выпуклым центром, диаметром (2,0±0,5) мм, роение подавлено.

Дифференциально-диагностические свойства среды проверяют методом посева тест штаммов Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis из разведения микробной взвеси 10^-6 совместно с E. coli из разведения 10^-5.

Результаты биологического контроля предложенной среды представлены в таблице.

Пример 2. Среду готовят в соответствии с примером 1.

Панкреатический гидролизат рыбной муки 23,0
Желчь очищенная 4,0
Глюкоза 10,0
Мочевина 5,0
Натрий хлористый 5,4
Бромтимоловый синий 0,128
Агар микробиологический 11,0
Вода дистиллированная до 1 л
PH 7,8±0,1
Результаты биологического контроля представлены в таблице и аналогичны результатам проверки по примеру 1.

Пример 3. Среду готовят в соответствии с примером 1.

Панкреатический гидролизат рыбной муки 25,0
Желчь очищенная 5,0
Глюкоза 12,0
Мочевина 6,0
Бромтимоловый синий 0,130
Агар микробиологический 12,0
Вода дистиллированная до 1 л
pH 7,8±0,1
Результаты биологического контроля представлены в таблице и аналогичны результатам проверки по примеру 1.

Пример 4. Среду готовят в соответствии с примером 1.

Панкреатический гидролизат рыбной муки 18,0
Желчь очищенная 2,0
Глюкоза 6,0
Мочевина 3,5
Натрий хлористый 4,0
Бромтимоловый синий 0,11
Агар микробиологический 9,0
Вода дистиллированная до 1 л
pH 7,8±0,1
Нарушение количественного соотношения компонентов среды ведет к резкому ухудшению ростовых свойств среды.

Результаты биологического контроля представлены в таблице.

Пример 5. Среду готовят с примером 1.

Панкреатический гидролизат рыбной муки 27,0
Желчь очищенная 6,0
Глюкоза 14,0
Натрий хлористый 7,0
Бромтимоловый синий 0,14
Агар микробиологический 14,0
Вода дистиллированная до 1 л
pH 7,8±0,1
Результаты биологического контроля представлены в таблице и аналогичны результатам проверки по примеру 4.

Из таблицы видно, что предлагаемая питательная среда, приготовленная в соответствии с примерами 1, 2, 3, обладает хорошими ростовыми свойствами, высокой точностью дифференциации Y. enterocolitica и Y. preudotuberculosis, от других энтеробактерий, подавляет рост и роение протея.

Нарушение количественного соотношения компонентов среды ведет к резкому ухудшению микробиологических показателей качества предложенной среды.

Так, в случае приготовления среды в соответствии с примерами 4,5 наблюдается резкое уменьшение диаметра колоний Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis, а также роение тест-штамми Pr. mirabilis на чашках.

Таким образом, по сравнению со средой-прототипом предлагаемая питательная среда имеет ряд преимуществ:
сокращение времени инкубации до 24 ч вместо 48 ч на среде прототипе, что позволяет ускорить предварительный диагноз;
улучшены дифференцирующие свойства, резко подавлено роение Pr. mirabilis;
очень проста в приготовлении, не требует автоклавирования, достаточно 5 мин кипячения.

Источники информации
1. Biolife Manual sleond edition, 1991
2. Handbook Culture Media MERCK (1982)
3. The manual of microbiological culture media (Cibco BRL, 1988)
4. Справочник по микробиологическим питательным средам. Под ред. М.М. Меджидова, Дагестанское кн. изд, Махачкала, 1989.

5. Ценева Г.Я. Иерсиниоз и псевдотуберкулез, Санкт-Петербург, 1992.

Использование: медицинская микробиология, диагностика кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза. Сущность изобретения: дифференциально-диагностическая питательная среда для выделения возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза содержит панкреотический гидролизат рыбной муки, желчь очищенную сухую, глюкозу, мочевину, хлористый натрий, бромтимоловый синий, агар при определенном сбалансированном соотношении компонентов. Количественное соотношение компонентов среды ее pH обеспечивают хорошую первичную дифференциацию иерсиний и от других энтеробактерий уже через 24 ч. 1 табл.

Дифференциально-диагностическая питательная среда для выделения возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза, содержащая источник азотного питания, желчь, мочевину, глюкозу, натрий хлористый, краситель бромтимоловый синий, агар микробиологический и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что в качестве источника азотного питания она содержит панкреатический гидролизат рыбной муки, а из желчи желчь очищенную, сухую с пониженным содержанием белка, липидов, пигментов Fe, P, Mg и Cа при следующем соотношении компонентов, г/л:
Панкреатический гидролизат рыбной муки 20 25
Желчь очищенная 3 5
Глюкоза 8 12
Мочевина 4,5 6,0
Натрий хлористый 5 6
Бромтимоловый синий 0,12 0,13
Агар микробиологический 10 12
Вода дистиллированная До 1 л
рН 7,8 ± 0,1.