ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ГЕМОРРАГИЧЕСКОГО КОЛИТА С ГЕМОЛИТИКО-УРЕМИЧЕСКИМ СИНДРОМОМ, ВЫЗЫВАЕМОГО КИШЕЧНОЙ ПАЛОЧКОЙ 0157:Н7 (СОРБИТОЛ E.COLI 0157:Н7АГАР) Российский патент 1999 года по МПК C12N1/20 C12Q1/10 C12N1/20 C12R1/19 

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и может быть использовано для выявления кишечной палочки 0157:Н7 в объектах окружающей среды, пищевых продуктах и от больных людей.

Этиологическая роль Е. coli 0157:Н7 как возбудителя геморрагического колита установлена сравнительно недавно. Тем не менее вспышки и спорадические случаи острых кишечных инфекций, вызываемых Е. coli 0157:Н7, уже зарегистрированы в большинстве стран мира: США, Канаде, Великобритании и Японии.

Не менее тревожная обстановка сложилась в Российской Федерации. В течение 1994-95 гг. зарегистрировано 35 вспышек острых кишечных инфекций водного и 137 вспышек пищевого характера, в результате которых заболело свыше 19 тыс. человек. В первом квартале 1996 г в России произошло 16 вспышек острых кишечных инфекций. Около 60% заболевших составили дети до 14 лет, при этом более половины из них в возрасте до 2 лет. Этиология большинства случаев острых кишечных инфекций, в том числе осложненных гемолитико-уремическим синдромом, остается невыясненной. С большой вероятностью можно предположить, что среди нерасшифрованных острых кишечных инфекций имеет место инфекция, вызываемая энтерогеморрагическими Е. coli серотипа 0157:Н7.

Большую озабоченность вызывает быстрый рост заболеваемости и высокая смертность (до 2,5%).

Сложная санитарно-эпидемическая ситуация в России (завоз мяса, мясных и молочных продуктов из-за рубежа, широкая сеть частных предприятий торговли и питания) требует более тщательного проведения бактериологического контроля с применением специальных питательных сред с целью быстрого обнаружения возбудителя данного заболевания и пресечения завоза возбудителя с продуктами питания из-за заграницы.

В России в настоящий момент отсутствуют питательные среды для выделения кишечной палочки 0157:1-Н7 - возбудителя геморрагического колита с гемолитико-уремическим синдромом. Угроза заноса данного возбудителя в Россию и появление вспышки данного заболевания внутри страны являются предпосылками для создания такой среды.

Ведущими зарубежными фирмами Difco, bioLife, Merck выпускаются среды для выделения кишечной палочки 0157:Н7 Mac Conkey Sorbitol Agar, Fluorocult E. coli 0157:Н7 agar (1, 2, 3).

Наиболее близкой по назначению к предлагаемой среде является Mac Conkey Sorbitol Agar, выпускаемой фирмами bioLife (2), состоящей из следующих компонентов, г/л:
Peptomeat - 17,0
Peptocomplex - 3,0
Bile Salts N 3 - 5,0
D-Sorbitol - 10,0
Sodium chloride - 5,0
Neutral Red - 0,03
Cristal Violet - 0,001
MUG - 0,1
Agar Bios LL - 14,5
Использование этой среды позволяет четко дифференцировать штаммы серогруппы 0157:Н7 от других эшерихий.

Недостатками этой среды являются многокомпонентный состав, включающий дорогостоящие мясные казеиновые перевары и экстракты, а также среда требует автоклавирования, что затрудняет ее использование в полевых условиях. Отсутствие этих сред на российском рынке не обеспечивает достаточного опыта работы с этой средой в практике здравоохранения.

В связи с вышеизложенным задачей изобретения является создание отечественной питательной среды из дешевых компонентов, обеспечивающей возможность использовать среду в полевых условиях с целью первичного выделения и дифференциации возбудителя геморрагического колита с гемолитико-уремическим синдромом - кишечной палочки 0157:Н7, отражающей условия и стереотипы работы наших диагностических лабораторий и сводящей до минимума перестройку производственного процесса при выпуске среды.

Поставленная задача решается сбалансированностью компонентного состава среды, содержащей в качестве белкового компонента панкреатический гидролизат рыбной муки, в качестве углеводного компонента - сорбитол, кроме этого, экстракт пекарных дрожжей, натрия сульфит, натрия хлорид, натрия фосфат, фуксин основной в качестве красителя и агар микробиологический при следующем соотношении компонентов, г/л:
панкреатический гидролизат рыбной муки - 10,0-14,0
экстракт пекарных дрожжей - 0,8-1,2
сорбитол - 8,0-12,0
натрия хлорид - 3,0-4,0
натрия сульфит - 0,75-0,85
натрия фосфат - 0,45-0,55
фуксин основной - 0,18-0,22
агар микробиологический - 8,0-12,0
дистиллированная вода - остальное
Количественное соотношение компонентов позволяет обеспечивать хорошую первичную дифференциацию штаммов серогруппы Е. coli 0157:H7 от других эшерихий через 16-18 часов. Производство панкреатического гидролизата рыбной муки и экстракта пекарных дрожжей налажено в отделении "Питательные среды" ГНЦ ПМ, поэтому выпускать данную среду в условиях уже имеющихся производств ГНЦ ПМ возможно без изменения технологических процессов и дополнительных материальных затрат.

Пример 1.

Для приготовления питательной среды берут следующие навески компонентов, г/л:
панкреатический гидролизат рыбной муки - 12,0
экстракт пекарных дрожжей - 1,0
сорбитол - 10,0
натрия хлорид - 3,4
натрия сульфит - 0,8
натрия фосфат - 0,5
фуксин основной - 0,2
агар микробиологический - 10,0
дистиллированная вода - остальное
Навески тщательно перемешивают в 1 л дистиллированной воды, нагревают до кипения и кипятят в течение 2-3 мин до полного растворения агара. Охлаждают до 45-50^oС и разливают в чашки Петри слоем 5-7 мм. Перед посевом чашки со средой подсушивают в течение 30 мин при комнатной температуре.

Эффективность среды проверяли на следующих тест-штаммах: Е. coli 0157:Н7 (NN 904, 1282, 120, 212, 214); Е. coli 3912/41 (055:K59); Shigella dysenteriae 1 1362; Salmonella paratyphi A, B; Salmonella typhimurium 79; S. aureus Wood-46; S. faecalis.

Микробную взвесь каждого из тест-штамма, приготовленного в стерильном 0,9%-ном растворе хлорида натрия с концентрацией, соответствующей 10 единицам по стандарту мутности путем десятикратных разведений доводили до концентрации 100 м.к./мл. На чашку Петри со средой засевали по 0,1 мл микробной взвеси каждого из тест-штамма из разведения с концентрацией 100 м.к./мл. Посевы инкубировали при температуре (37±1)^oC в течение 18-20 ч. Учет результатов проводили визуально. Через 18-20 ч культивирования колонии тест-штамма Е. coli 0157:Н7 были бесцветные, круглые, диаметром 1,5-2,0 мм; колонии тест-штаммов Е. coli 3912/41 (055:K59), Salmonella paratyphi А, В, Salmonella typhimurium 79 - малиновые, с металлическим блеском, круглые, ровные, диаметром 1,5-2,5 мм, колонии тест-штамма Shigella dysenteriae 1 1362 - розовые, мелкие, круглые, диаметром до 1,0 мм. Рост S. aureus Wood-46 и S. faecalis полностью отсутствует.

Пример 2.

Для приготовления питательной среды берут следующие навески компонентов, г/л:
панкреатический гидролизат рыбной муки - 10,0
экстракт пекарных дрожжей - 0,8
сорбитол - 8,0
натрия хлорид - 3,0
натрия сульфит - 0,75
натрия фосфат - 0,45
фуксин основной - 0,18
агар микробиологический - 8,0
дистиллированная вода - остальное
Приготовление и биологический контроль среды проводили в соответствии с примером 1. Результаты контроля представлены в таблице.

Пример 3.

Для приготовления питательной среды берут следующие навески компонентов, г/л:
панкреатический гидролизат рыбной муки - 14,0
экстракт пекарных дрожжей - 1,2
сорбитол - 12,0
натрия хлорид - 4,0
натрия сульфит - 0,85
натрия фосфат - 0,55
фуксин основной - 0,22
агар микробиологический - 12,0
дистиллированная вода - остальное
Приготовление и биологический контроль среды проводили в соответствии с примером 1. Результаты контроля представлены в таблице.

Из таблицы видно, что предлагаемая питательная среда обладает хорошими ростовыми свойствами, высокой точностью дифференциации штаммов серогруппы Е. coli 0157:Н7 от других энтеробактерий, подавляет рост стафилококка и стрептококка.

Нарушение количественного соотношения компонентов среды ведет к резкому ухудшению показателей качества предложенной среды и затрудняет дифференциацию.

Таким образом, по сравнению со средой-прототипом предлагаемая среда имеет ряд преимуществ:
не содержит дорогостоящих мясных и казеиновых переваров и экстрактов;
улучшает дифференциацию за счет появления металлического блеска колоний;
проста в приготовлении: не требует автоклавирования, достаточно 3 минут кипячения;
возможно применение в полевых условиях;
не меняет стереотипов работы диагностических лабораторий практического здравоохранения.

Источники информации принятые во внимание
1. Difco, Laboratories PO BOX 331058 Detroit Mi 48232-7058 USA, 1992, р. 3.

2. BioLife Manual, Second edition, printed in Italy, by INGRAF, Milan, 1991, p. 88.

3. Microbiology Manual, Merck, 1996, p. 316.

Изобретение касается медицинской микробиологии и может быть использовано для выявления кишечной палочки 0157 : H7 в объектах окружающей среды, пищевых продуктах и от больных людей. Среда содержит в качестве белкового компонента панкреатический гидролизат рыбной муки, в качестве углеводного компонента - сорбитол, кроме этого, экстракт пекарных дрожжей, натрия сульфит, натрия хлорид, натрия фосфат, фуксин основной в качестве красителя и агар микробиологический и воду при определенном соотношении компонентов. Изобретение обеспечивает возможность использовать среду в полевых условиях для первичного выделения и дифференциации возбудителя геморрагического колита. Среда проста в приготовлении, улучшает дифференциацию за счет появления металлического блеска колоний. 1 табл.

Питательная среда для выделения возбудителя гемморрагического колита с гемолитико-уремическим синдромом, содержащая источник азотного питания, сорбитол, натрия хлорид, краситель, агар микробиологический, воду дистиллированную, отличающаяся тем, что в качестве источника азотного питания содержит панкреатический гидролизат рыбной муки, в качестве красителя - фуксин основной и дополнительно содержит экстракт пекарных дрожжей, натрия сульфит и натрия фосфат при следующем соотношении компонентов, г/л:
Панкреатический гидролизат рыбной муки - 10,0 - 14,0
Экстракт пекарных дрожжей - 0,8 - 1,2
Сорбитол - 8,0 - 12,0
Натрия хлорид - 3,0 - 4,0
Натрия сульфит - 0,75 - 0,85
Натрия фосфат - 0,45 - 0,55
Фуксин основной - 0,18 - 0,22
Агар микробиологический - 8,0 - 12,0
Дистиллированная вода - Остальное