ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КОКЛЮШНОГО МИКРОБА Российский патент 1998 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано при диагностике коклюша.

За рубежом ведущие фирмы ("Difco", "Gibco", "BBL") выпускают в сухом виде среды для культивирования и выделения коклюшного микроба, содержащие в своем составе бактопептоны, экстракты мяса, ферментативные гидролизаты казеина, желатина, витамины и 10 15% дефибринированной крови.

Эти среды богаты по питательным ценностям, но сложны по составу [1-4]
В настоящее время в микробиологической диагностике коклюша используется ряд сред лабораторного изготовления: среда Борде-Жангу (картофельно-глицериновый агар), молочно-кровяной агар. В промышленном производстве эти среды не выпускаются, при лабораторном изготовлении требуют больших материальных и временных затрат, нестандартны [5]
В нашей стране единственной коммерческой средой для диагностики коклюша является казеиново-угольный агар (КУА), выпускаемый в НПО "Питательные среды", г. Махачкала [6] которая состоит из следующих компонентов, г:
Гидролизат казеина 28,62
Экстракт дрожжей 2,86
Калий фосфорнокислый Однозамещенный 0,5
Медь сернокислая 0,005
Магний хлористый 0,4
Крахмал растворимый 2,0
Цистеин 0,3
Уголь активированный 5,0
Агар-агар 12,5-13,0
Вода дистиллированная До 1 л
Недостатками этой среды являются ее нестандартность, низкие ростовые качества, что вызывает серьезные нарекания со стороны санитарно-эпидемиологической службы. В процессе работы с казеиново-угольным агаром приходится предпринимать дополнительные меры для улучшения ее качества, повышения чувствительности путем дополнительного внесения в среды отдельных аминокислот, витаминов, крови, угля и т.д.

Задачей изобретения является создание промышленной сухой питательной среды, стандартной, обеспечивающей стабильность результатов при выделении коклюшного микроба.

Это достигается сбалансированностью компонентного состава среды, содержащей солянокислотный гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, агар, натрий хлористый, крахмал, уголь активированный, кроме того, дополнительно содержащей амилопектин, натрий углекислый при следующем содержании компонентов, г/л:
Солянокислотный гидролизат казеина 18,0-20,0
Дрожжевой экстракт 4,5 5,5
Натрий хлористый 4,5 5,5
Крахмал 1,5 2,5
Амилопектин 4,0 6,0
Уголь активированный 3,5 4,5
Натрий углекислый 0,5 0,7
Агар-агар 11,0 12,0
Вода дистиллированная Остальное
pH 7,0±0,2
Количественное соотношение компонентов питательной среды и ее pH обеспечивают повышенный уровень интенсивности роста коклюшного микроба и чувствительность среды.

Пример 1. Питательную среду готовят следующим образом. Навески ингредиентов взвешивают, тщательно перемешивают, растирают в ступке, переносят в колбу, растворяют в дистиллированной воде.

Закрыв колбу ватно-марлевой пробкой, стерилизуют при 120^oC в течение 20 мин. Охладив до температуры 45-50^oC, тщательно перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри. Получают питательную среду следующего состава, г/л:
Солянокислотный гидролизат казеина 19,0
Дрожжевой экстракт 5,0
Натрий хлористый 5,0
Крахмал 2,0
Амилопектин 5,0
Уголь активированный 4,0
Натрий углекислый 0,6
Агар 12,0
Вода дистиллированная Остальное
pH 7,0
Для биологического контроля питательной среды использовали культуру Bordeteiia pertussis музейных штаммов и свежевыделенные штаммы от больных коклюшем. Посевы культивировали при (37±0,5^oC).

Учет результатов проводят через 3-5 суток. Результаты представлены в таблице.

Пример 2. Питательную среду готовят как описано в примере 1, со следующим содержанием компонентов, г/л:
Солянокислотный гидролизат казеина 18,0
Дрожжевой экстракт 4,5
Натрий хлористый 4,5
Крахмал 1,5
Амилопектин 4,0
Уголь активированный 3,5
Натрий углекислый 0,5
Агар 11,0
Вода дистиллированная Остальное
pH 7,0
Проверка предлагаемой среды проводилась посевом музейных и свежевыделенных штаммов Bordeteiia pertussis.

Учет результатов проводили через 3 5 суток. Результаты аналогичны примеру 1.

Пример 3. Проверка предлагаемой среды производилась посевом музейных и свежевыделенных штаммов Bordetella pertussis на питательную среду с максимальным содержанием компонентов следующего состава, г/л:
Солянокислотный гидролизат казеина 20,0
Дрожжевой экстракт 5,5
Натрий хлористый 5,5
Крахмал 2,5
Амилопектин 6,0
Уголь активированный 4,5
Натрий углекислый 0,7
Агар микробиологический 13,0
Вода дистиллированная Остальное
pH 7,2
Учет результатов проводили через 3 5 суток.

Результаты аналогичны примеру 1.

Морфология колоний на испытанных средах идентична типичная для коклюшного микроба.

Из таблицы видно, что предлагаемая среда по чувствительности и интенсивности роста превосходит коммерческую среду.

Предлагаемая среда позволяет поддерживать жизнеспособность штаммов Bordetella pertussis (как свежевыделенных от больных, так и музейных) и дает возможность использовать ее для хранения культур.

Предлагаемая питательная среда пригодна для диагностических целей при выявлении больных коклюшем, а также для накопления биомассы.

Источники информации принятые во внимание при экспертизе
1. Handbook Culture Media MERCK, 1982.

2. The manual of microbiogical culture media (Gibco BRL, 1988).

3. The Oxoid manual of culture media, indredient and ofher laboratory services (Oxoid Limited, 1979).

4. Manual of BBL products and laboratory procedures, 1991.

5. Инструкция по бактериологическому и серологическому исследованиям при коклюше и паракоклюше. Минздрав СССР, 1983.

6. Каталог сухих питательных сред, выпускаемых в СССР для медицинской бактериологии, М. 1980, в.1,с.14.

Использование: биотехнология, медицинская микробиология, диагностика коклюша, питательная среда. Сущность: сухая питательная среда для выделения коклюшного микроба содержит солянокислотный гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, агар, натрий хлористый, крахмал, уголь активированный, амилопектин, натрий углекислый при сбалансированном определенном содержании компонентов. Количественное соотношение компонентов питательной среды и ее pH обеспечивают повышенный уровень интенсивности роста коклюшного микроба и чувствительность среды. 1 табл.

Питательная среда для выделения и культивирования коклюшного микроба, содержащая агар, кислотный гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, крахмал, минеральные соли, уголь активированный и воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит амилопектин, из минеральных солей натрий хлористый и натрий углекислый при следующей количественном соотношении компонентов, г/л:
Кислотный гидролизат казеина 18,0 20,0
Дрожжевой экстракт 4,5 5,5
Натрий хлористый 4,5 5,5
Крахмал 1,5 2,5
Амилопектин 4,0 6,0
Уголь активированный 3,5 4,5
Натрий углекислый 0,5 0,7
Агар 11,0 13,0
Вода Остальное
рН 6,8 7,2.