Способ выявления нервных волокон и сосудов микроциркуляторного русла Советский патент 1985 года по МПК G01N33/48 A61B10/00 

Од fO 1 Изобретение относится к области медицины, в частности в морфологии, и предназначено для изучения микроскопических структурных компонентов нервных волокон и сосудов мик роциркуляторного русла внутренних органов. Целью изобретения является повышение контрастности окраски. Способ осуществляют следующим образом. Изучаемые органы, например язык, поджелудочная железа, кожа, внепеченочные желчные протоки, малый сальник , подлежащие гистологической обр ботке с целью выявления нервных структур, вначале фиксируют в течение 7-10 дн. в 12%-ном растворе фор малина с рН 7,2-7,4.Для выявления микрососудов материал рекомендуется фиксировать в течение 20-25 дн. в 10%ном растворе формалина с рН в пределах 6,3-6,5. Указанные .параметры фи сации выработаны опытным путем. Нару шение их резко ухудшает в последующем качество выявляемых структур в препа ратах. После фиксации материал промывают сначала в проточной, а затем в дистиллированной воде для отмывки избытка формалину из тканей органов Для последующего выявления нервных структур материал следует промывать только в нескольких порциях дистилированной воды. Приготовленные на замораживающем микротоме гистологические срезы в количестве 3-4 помещают на 1.-15 мин. в 1-5%-ный раство диметилсульфоксида, приготовленного на дистилированной воде. Диметилсуль фоксид в более низкой концентрации, чем 1%, медленно проникает в ткани и, соответствелно, замедляет процесс диффузного проникновения красящего реактива. Более высокая концентрация (свыше 5%), а также увеличение веремени инкубации приводят в дальнейшем к деформации материала вследствие гидратации ткани и сморщиванию срезов. Из диметилсульфоксида срезы, предварительно осушив фильтровальной бумагой, переносят на 15-30 мин. в 5%-ный раствор азотно-кислого серебра. Преимущество использования 5%-ного раствора азотно-кислого серебра заключается в том, что эта концентрация оптимально обеспечивает выявление нервных структур и микрососудов. Превышение этой 902 концентрации ведет к неоправданным расходам кристал;1ического серебра. В целях получения препаратов для изучения интраорганных микрососудов срезы из азотно-ксилого серебра проводят через ряд ванночек с 1-2%ным раствором кислого формалина, приготовленного на ссмеси свежей водопроводной и дистиллированной воды в соотношении 1:1. Для выявления нервных компонентов срезы проводят через ванночки с 0,5-1%-ным раствором кислого формалина на смеси отстоявшейся водопроводной и свежеприготовленной кипяченой воды в соотношении 1:2. Допустимый предел рН растворов для обоих случаев должен быть 6,0-6,3. Превьппение концентрации указанных формалиновых растворов приводит к избыточному осаждению формалина на гистологических срезах, что затрудняет микроскопическое исследование препаратов. Применение свежекипяченой и отстоявшейся водопроводной воды продиктовано необходимостью уменьшения .концентрации хлоридов и карбонатов кальция, препятствующих связыванию ионов серебра белковыми структурами нервной ткани. В дальнейшем срезы переносят на 1-2 мин в раствор аммиачного серебра, в котором аммиака должно быть на 1-2 капли больше с целью подавления окрашивания элементов стромы. Из аммиачного серебра срезы помещают в 0,5-1%-ный раствор нейтрального формалина, приготовленниого на водопроводной воде комнатной температуры, до приобретения ими соломенного оттенка. Данный раствор применяют в том случае,, если необходимо дифференцировать в исследуемых тканях микроциркуляторное русло, поскольку стенки сосудов обладают слабой аргирофилией. Для окончательной дифференцировки нервных структур используют О,25-0,5%-ный раствор нейтрального формалина на свежей кипяченой воде. Увеличение концентрации формалина в обоих случаях приводит к гомогенному закрашиванию тканей. Фиксация окрашенных срезов осуществляется в аммиачной воде, приготовленной из расчета 1 ч аммиачного спирта,25%-ной концентрации и 4 ч. дистиллированной воды, в течение 1 ч. Затем срезы промьтают в дистиллированной воде в течение 12 ч. со сменой воды 1-2 раза Обезвоживание в спиртах, карбол-кси лоле, ксилоле, заключение в бальзам производится известным способом. Пример 1. Выявление нервног аппарата языка, Подлежещие гистологической обработке кусочки языка с целью выявлени нервных структур фцксируют в течение 10 дн. в 12%-ном растворе формалина с рН 7,2-7,4. После фиксации материал промывают в течение 2 ч. в нескольких пор циях дистиллированной воды. Затем приготавливают на замораживающем ми ротоме гистологические срезы языка и в количестве 3-4 помещают на 12 ми в 1%-ный раствор диметилсульфоксида, приготовленного на дистиллированной воде. Из диметилсульфоксида срезы, предварительно осушив фильтровально бумагой, переносят на 15 мин в 5%-ны раствор азотно-кислого серебра. Пос ле азотно-кислого серебра срезы про водят через В1анночки с 0,5%-ным раствором кислого формалина на смеси отстоявшейся водопроводной и и свежеприготовленной кипяченой воды в соотношении 1:2. Срезы из фор малиновой ванночки переносят на 1-2 мин в раствор аммиачного серебра, в котором аммиака должно быть на 1-2 капли больше. Для окончательной дифференцировки нервных структур срезы помещают в 0,25%-ный раствор нейтрального формалина, приготовлен ного на свежей кипяченой воде до приобретения ими светло-табачного оттенка. Фиксация срезов осуществляется в аммиачной воде, приготовленной из расчета 1 ч. аммиачного Ьпирта 25%-ной концентрации на 4 ч. дистиллированной воды на 1 ч. Затем срезы промывают в дистиллированной воде в течение 12 ч со сменой воды 1-2 раза. Обезвоживание в спиртах, карболксилола, ксилоле, заключение а бальзам производят по общепринятой методике. П р и м е р 2. Выявление нервного аппарата кожи. Подлежащие гистологической обработке кусочки кожи с целью вьивления структур фиксируют в течение 10 дн. в 12%-ном растворе формалина с рН 7,2-7,4. После фиксации материал промывают в течение 2 ч в нескольких порциях дистштлирован 904 ной воды. Затем приготавливают на замораживающем микротоме гистологические срезы кожи и в количестве 3-4 помещают на 15 мни в 5%-ный раствор диметилсульфоксида, приго- , товленного на дистиллированной воде. Из диметилсульфоксиде срезы, предварительно осушив фильтровальной бумагой, переносят на 30 мин в 10%-ный раствор азотно-кислого серебра. После азотно-кислого серебра срезы проводят через ванночки с 1%-ным раствором кислого формалина на смеси отстоявшейся водопроводной и свежеприготовленной кипяченой воды в соотношении 1:2. Срезы из формалиновой ванночки переносят на 1-2 мин в раствор аммиачного серебра, в котором аммиака должно быть на 1-2 капли больше. Дпя окончательной дифференцировки нервных структур срезы помещают в О,5%-ный раствор нейтрального формалина, приготовленного на свежей кипяченой воде до приобретения ими светло-табачного оттенка. Фиксация срезов осуществляется в аммиачной воде, приготовленной из расчета 1 ч. аммиачного спирта 25%-ной концентрации и 4 ч. дистиллированной воды на 1 ч. Затем срезы промывают в дистиллированной воде в течение 12 ч со сменой воды 1-2 раза. Обезвоживание в спиртах, карболксилоле, ксилоле, заключение в бальзам по общепринятой методике. П р и м е р 3. Выявление внутрирганных сосудов микроциркуляторноо русла в языке. Подлежещие гистологической обраотке кусочки языка с целью выявения микрососудов фиксируют в теение 25 дн. в 10%-ном расворе форалина с рН 6,3-6,5. После фиксации усочки языка промывают сначала водопроводной,а затем в дистиллиованной воде в течение 3-4 ч. Приотовленные на замораживающем микрооме гистологические срезы языка количестве 10-15 помещают на 15 ин в 1%-ный раствор диметисульфокида, приготовленного на дистиллиованной воде. Из диметилсульфокида срезы предварительно осушив ильтровальной бумагой, переносят а 15 мин в 5%-ный раствор азотно-кисого серебра. После азотно-кислого еребра срезы пр зводят через ряд

ванночек с 1%-ным раствором кислого формалина, приготовленного на свежей водопроводной и дистиллированной воде в соотношении 1:1. Затем срезы переносят на 1-2 мин в раствор аммиачного серебра. Из аммиачного серебра срезы помещают в 0,5%-ный раствор нейтрального .формалина, приготовленного на водопроводной воде комнатной температуры до приобретения ими соломенного оттенка. Фиксация срезов осуществляется в аммиачной - воде из расчета 1 ч. 25%ного спирта и А ч. дистиллированной воды в течение 1ч. Затем срезы промывают в дистиллированной, воде в течение 12 ч.

Обезвоживание в спиртах, карболксилоле, ксилоле,заключение в бальзам по общепринятой методике.

П р и м е р 4. Выявление внутриорганных сосудов микроциркуляторного русла в коже.

Подлежавр е гистологической обработке кусочки кожи с целью выявления микрососудов фиксируют в течение 25 ди, в 10%-ном растворе формалина с рН 6,3-6,5. После фиксации кусочки кожи промывают сначала в водопроводной,, а затем в дистиллированной воде в течение 3-4 ч. Приготовленные на замораживающем микротоме гистологические срезы кожи в количестве 10-15 помещают на 12 мин в 5%-ный раствор диметилсульфоксида, приготовленного на дистиллированной воде. Из диметилсульфоксида срезы, предварительно осушив

фильтровальной бумагой, переносят на 30 мин. в 10%-ный раствор азст, но-кислого серебра. После азотно-ки5 лого серебра срезы проводят через ряд ванночек с 2%-ным раствором кислого формапина, приготовленного из свежей водопроводной и дистиллированной воды в соотношении 1:1.3аJQ тем срезы переносят на 1-2 мин в раствор аммиачного серебра.

. Из аммиачного серебра срезы помещают в 1%-ный pacTEfop нейтрального формапина, приготовленно)5 го на водопроводной воде комнатной гемпературы до приобретения ими соломенного оттенка. Фиксация срезов осуществляется в аммиачной воде из расчета 1 ч. 25%-ного

20 аммиачного спирта и 4 ч. дистиллированной воды в течение 1 ч. Затем срезы промывают в дистиллированной воде в течение 12 ч. Обезвоживание в спиртах, карболксилоле,

25 ксилоле, заключение в бальзам по общепринятой методике.

Полезность и эффективность предлагаемого способа заключается в количестве выявляемых нервных и сосудистых структур на единицу площади среза, зкономии азотно-кислого серебра. Впервые предлагаемым способом можно выявить интреорганные компоненты нервных структур и сосудов микроциркуляторного русла в различных по своей морфологической природе органах и тканях.

СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ НЕРВНЫХ .ВОЛОКОН И СОСУДОВ МИКРОЦИРКУЛЯТОРНОГО РУСЛА путем фиксации ткани в 10-12%/ СЕп. ном формалине, приготовлеиия гистологических срезов, окраски и азотнокислом серебре, восстановления в растворах формалина, обр аботки в аммиачном серебре и повторно в растворах формалина, отличающийся тем, что, с целью повышения контрастности окраски, срезы перед окраской в 5-10%-ном растворе азотно-кислого серебра обрабатывают в 1-5%ном растворе диметилсульфоксида, а восстановление ведут в водных растворах формалина в следующих соотношениях для сосудов и нервных волокон 1:1 и 1:2 соответственно с последующей повторной обработкой в 0,25-1%(О ном растворе формалина.