Способ определения микроколичеств ДНК Советский патент 1990 года по МПК G01N21/64 C09K11/06 C12N15/00 

Изобретение относится к области биохимии и молекулярной биологии и может быть использовано для контроля

содержания ДНК в условиях низких концентраций полинуклеотида, в частности, в радиобиологии при оценке повреждающих воздействий излучения, а также в медицине при диагностике некоторых видов заболеваний.

Цель изобретения - повышение чувствительности и удешевление способа определения микроколичеств ДНК.

Основу предлагаемого спососба составляет использование нового флуоресцентного красителя 2 -Г2- (4-оксифи- нил)-5(6)-бензимидазолил 5(6)-(1-пи- перазинил)-бензимидазола формулы

У

13C H VOH

н н

(I)

в условиях, оптимальных для образования специфического комплекса данного красителя с ДНК (при рН &, 1+0,6).

Флуоресцентный краситель (1) характеризуется Л6015 350+2 нм и & f4vop 460+2 нм. Измерение интенсивности флуоресценции (ИФ) проводят до(ИФ ) и после (ИФ,) взаимодействия красителя (I; с анализируемым раствором ДНК, а также после добавки в кювету раствора ДНК (ИФ2 ) известной концентрации. Расчет искомой концентрации, мкг/мл, ДНК осуществляют по формуле

С -

ст

ГЦ п,

ИФ, - ИФ0 ИФ2 - ИФ,

где С

ст

п

п

2

иФо

ИФ„ 0

5

0

концентрация стандартной ДНК, мкг/мл; разбавление исследуемой пробы в кювете измерения , разбавление стандартной ДНК в кювете измерения; интенсивность фоновой флуоресценции;

ИФ, итенсивность флуоресценции , окрашенной (Т); интенсивность флуоресценции пробы после добавки раствора стандартной ДНК. Предлагаемый метод позволяет определять содержание ДНК в растворах с концентрацией до 3-10 мкг/мл (нижняя граница чувствительности), что примерно в 1,5-2 раза ниже предела чувствительности для известных флуоресцентных красителей ДАФИ и Хехст-33258. В силу достаточно высокой специфичности красителя (I) метод определения микроколичеств ДНК может быть использован при анализе содержания ДНК в биологических материалах, в частности в плазме крови.

Пример 1. Синтез флуоресцентного красителя (I) осуществляют по схеме

Изобретение относится к биохимии и молекулярной биологии и может быть использовано для контроля за содержанием ДНК в условиях низких концентраций полинуклеотида, в том числе при его выделении и очистке, в работах по радиобиологии при оценке повреждающих воздействий ионизирующего излучения, а также в медицине при диагностике некоторых видов заболеваний. Целью изобретения является повышение чувствительности способа определения микроколичеств ДНК при одновременном его удешевлении. Основа нового способа- использование нового флуоресцентного красителя 2-[2-(4-оксифенил)-5(6)-бензимидазолил]-5(6)-(1-пиперазинил)-бензимидазола в условиях, оптимальных для образования специфического комплекса этого красителя сДНК. Измерение интенсивности флуоресценции (ИФ) проводят до взаимодействия красителя с анализируемой ДНК, после него и после добавки в ту же кювету раствора ДНК известной концентрации. Расчет искомой концентрации полинуклеотида осуществляют по формуле C(X)=C_ст^.(N₁:N₂)^.[(ИФ₁-ИФ₀):(ИФ₂-ИФ₁)], где C_ст - исходная концентрация стандартного раствора ДНК, мкг/мл

N₁ - разбавление исследуемой пробы в кювете

N₂ - разбавление стандартного раствора ДНК в кювете, ИФ₀ - интенсивность фоновой флуоресценции

ИФ₁ - интенсивность флуоресценции окрашенной пробы

ИФ₂ - интенсивность флуоресценции пробы после добавки стандартного р-ра ДНК. Предложенный метод позволяет определять содержание ДНК в растворах с концентрацией в 1,5 - 2 раза ниже, чем известные способы, использующие коммерческие флуоресцентные красители ДАФИ и Хехст-33258. Благодаря достаточно высокой специфичности нового метода он может быть с успехом применен при анализе низких концентраций ДНК в биологических материалах, в частности в плазме крови. 5 табл.

Г№Ь/f -гНыГ;ш тг

HN

/

V

ш,со

3 чо

.МНг ПСНзСС

N02 гШ-i/NicK

сн

мс

NHo C17HN: ,-ъ

+г с-О-он

-мнгш jr:

ixШ. н т

- в сн3оснгснг mi

-N

ч V

N

н

rVv JL

lUi-yi- Ac--NQNi)

Чистоту продуктов контролируют методом ТСХ на пластинах Silufol-UV-254

о

.t-NTVt v™

н т

rVvoH ChmW JL ROH uo/c-|;

в системах: А - хлороформ - метанол (9:1), Б - хлороформ - метанол - 25%

ный аммиак (1 6:4:1 )j В - ацетон - гек сан (1:2); Г - хлороформ - уксусная кислота - метанол (6:3:1).

Выход (I) 93%. Т.пл. 300°С.

Найдено,%: М4 410.

CMHMN60.

Вычислено,%: F+ 410,49.

УФ-спектр, . , нм (lgЈ)B этаноле: 263(4,49), 342().

Пример 2. Определение содержания ДНК в пробе с неизвестной концентрацией предлагаемым и известным способами.

В стандартную кювету на 10 мм флу- ориметра (полный объем кюветы 4 ,0 мм), содержащую 1,0 мл 0,01 М трис-буфера, 0,01 М трилона Б и 0,1 М NaCl (pH 8,1 добавляют 0,05 мл раствора красителя (I) до конечной концентрации rv мкг/мл и измеряют фоновую (ИФ) Флуоресценцию ( 3fco,,6 350 нм;

регистр 460 нм), затем добавляют 0,02 мл раствора ДНК из тимуса крысы неизвестной концентрации и снова измеряют интенсивность флуоресценции (ИФ( ), после чего вносят известное количество той же ДНК и повторяют процедуру измерения интенсивности флуоресценции (ИФ2) . После внесения добавок содержимое кюветы перемешивают 8-12 с. Неизвестную концентрацию ДНК в анализируемой пробе рассчитывают по указанной формуле.

В варианте исполнения вместо кра- сителя (I) используют флуоресцентный краситель ДАФИ ( up&rv,ttp 450 нм), а реакцию проводят при рН 7,0.

Результаты анализа приведены в табл.1.

Из приведенных данных следует, что использование (Т) дает достоверные результаты, близкие получаемым по известному способу (различия составляют не более 10%).

Пример 3. Определение ИФ и ЛИФ для разбавленных растворов ДНК.

В кювету, содержащую буфер (пример 2) и краситель ((I), ДАФИ или Хехст), в конечной концентрации 19,6 НО мкг/мл после измерения ИФ0 добавляют определенное количество раствора ДНК из тимуса крысы с известной концентрацией и после переме- шивания измеряют ИФ,.

Зависимость 4ИФ от концентрации ДНК в пробе, окрашенной различными красителями, приведена в табл.2.

0

5

5

Ю

5

0

е

0

5

0

Полученные данные позволяют заключить, что в случае применения (I) при всех концентрациях ДНК больше 0,3210 эмкг/мл величина ЛИФ прямо пропорциональна концентрации ДНК в анализируемом растворе. При концентрации ДНК ниже этого значения нарушается линейность взаимного изменения названных величин и возрастает ошибка измерения параметра ЛИФ ПФпр . Вследствие этого концентрацию ДНК 0,31 О 5 мкг/мл можно считать нижней границей чувствительности метода определения с помощью (I).

Кроме того, определение микроколичества ДНК при использовании красителя (Т) оказывается более эффективным по сравнению с известными.

При концентрациях ДНК меньше 0,67х НО мкг/мл ИФ и соответственно ДИФ при использовании ДАФИ имеют очень низкие значения, а использование Хех- ста оказывается практически невозможным.

Пример 4. Определение относительного квантового выхода для (I) ДАФИ и Хехст 33258.

Определение проводят в буферном растворе этого же состава, что в примере 1 (рН для ДАФИ и Хехста 7,2, для (I) 8,1). Конечная концентрация красителя во всех случаях 0,09 мкг/мл, ьо}б - 350 нм; щельво}р 5 нм; щелърегмстр 15 нм, для ДАФИ регистр 450 нм, а для Хехстэ 33258 и для (I) регистр 460 нм.

Результаты анализа приведены в табл.3.

Как следует из табл.3, квантовый выход предлагаемого красителя (I) в 1,46+0,12 раза выше, чем известных красителей Хехста-33258 и ДАФИ.

Пример 5. Определение зависимости ДИФ от рН среды.

Состав буферного раствора, как в примере 1. Концентрация красителя (I) 1 мкг/мл. Концентрация ДНК в пробе 9,4 мкг/мл.

Полученные данные приведены в табл.4.

Из табл.4 следует, что ДИФ имеет максимальное и постоянное значение при рН от 7,5 до 8,7.

Пример 6. Определение содержания ДНК в биологическом материале.

Плазму крови белых бегпородных мышег через 22 ч после гамма-облучения в дозе 8 г и плазму крови интякт

ных животных объемом 0,02-0,05 мл .бе какой-либо предварительной обработки вносят в стандартную кювету на 10 мм измерения флуориметра, содержащую 1,0 мл буфера (0,01 М трис, 0,01 W трилон Б, 0,1 М хлористый натрий рН 8,1) и определяют интенсивность флуоресценции ИФ0 при ЪЪОЬъ 350нм щели Во}Б 5 нм. регмотр - 460 нм щели регистр нм. После этого добавляют 0,05 мл красителя (I), исходная концентрация 2 мкг/мл и измеряют ИФ(|, затем в эту же кювету добавляют 0,02 мл раствора ДНК тимуса крысы с известной концентрацией (3,7 мкг/мл) и определяют ИФг.

Результаты измерения опытов приведены в табл.5.

Измерение концентрации ДНК в плаз ме мышей предлагаемым способом позволяет выявить известный феномен снижения уровня ДНК после облучения.

Минимальное количество ДНК, определяемое в этих случаях в кювете, составляет для плазмы облученных мышей 0,372 мкг/мл, а для реперной ДНК 0,066 мкг/мл.

Примечание. Разбавление проводят при п 53,5 и п2 54,5.

Таблица 2

ДАФИ

Хехест (I)

0

5

5

Использование изобретения обеспечит возможность осуществления быстрого, простого и экономичного анализа содержания ДНК в растворах с концентрациями в 1,5-2 раза ниже, чем при использовании наиболее чувствительных из известных флуоресцентных красителей .

Формула изобретения

Способ определения микроколичеств ДНК, включающий обработку раствора полидезоксирибонуклеотида флуоресцентным красителем, определение интенсивности флуоресценции образующегося комплекса и сравнение ее с интенсивностью флуоресценции стандартного раствора ДНК, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и удешевления анализа, в качестве красителя используют (4-оксифенил)-5(6)-бензими- дазолилТр5(6)-(1 -пилеразинил)-бензи- мидаз ол, а реакцию с ДНК проводят при рН 7,5-8,7.

Таблица 1

Таблица 3

Таблица 4