Изобретение относится к полипептидам, найденным в яде паука Filistata hibernalis, и к полипептидам, имеющим практически такую же аминокислотную последовательность и существенно такую же активность, что и названые полипептиды. Эти полипептиды и их фармацевтически приемлемые соли блокируют кальциевые каналы в клетках, включая нейронные и мышечные клетки различных организмов, включая беспозвоночных и позвоночных. Это изобретение также относится к использованию указанных полипептидов и их солей при блокировании кальциевых каналов в клетках, таких как клетки в нервной и мышечной системе организма, как таковых и при лечении заболеваний и состояний, переносимых через кальциевый канал млекопитающих. Кроме того, это изобретение относится к композициям, включающим указанные полипептиды и их соли.
Вещества, которые являются кальциевыми антагонистами, имеют множество применений. Кальциевые антагонисты могут найти клиническое применение при лечении таких состояний, как ангина, гипертония, кардиомиопатия, наджелудочковая аритмия, аэзофогеальная ахалазия, преждевременные роды и заболевание Рэйнауда, среди прочих. (см. В.Г.Нейлер. Кальциевые антагонисты. Изд-во Академик Пресс, Харкоурт Брэйс Джованович, Нью Йорк, 1988). Кроме того, такие соединения являются полезными при изучении физиологии клеток, таких как нейронные и мышечные клетки.
Это изобретение относится к полипептидам, которые, как было обнаружено, присутствуют в яде паука Filistata hibernalis. Полипептиды этого изобретения и фракции, в которых они присутствуют, в соответствии с этим изобретением являются следующими (см. в конце описания).
Полипептиды этого изобретения блокируют кальциевые каналы в клетках. Соответственно, эти полипептиды являются полезными при блокировании кальциевых каналов в клетках, как таковых. Эти полипептиды также являются полезными при подавлении беспозвоночных паразитов и при лечении заболеваний и состояний у млекопитающих, которые переносятся с помощью функции кальциевых каналов в клетках.
Кроме того, в объеме защиты этого изобретения находятся полипептиды, которые имеют практически такую же самую аминокислотную последовательность и такую же самую активность блокирования кальциевых каналов, как и описанные выше полипептиды.
Это изобретение также относится к фармацевтическим композициям, включающим указанные полипептиды, и способы назначения таких полипептидов.
Яд получают из паука Filistata hibernalis по способу выдаивания посредством электрического стимулирования, используя методики, хорошо известные специалистам в этой области. Предпочтительной является такая методика, при которой принимаются меры защиты от загрязнения всего яда абдоминальной отрыжкой или лимфой крови. Такие методики хорошо известны специалистам в этой области медицины. Полученный таким образом цельный яд хранится в замороженном состоянии приблизительно при -78oC до использования для очистки, как описано ниже. Очистка составных частей из цельного яда осуществляется методом жидкостной хроматографии высокого разрешения с обращенной фазой (ЖХВР) на разработанных препаративных и полупрепаративных колонках, таких как C-4 и C-18 Видак (зарегистрированный товарный знак, фирма Рэйнинн Инструмент Ко. Инк. , Мак Роуд, Вобурн, шт.Массачузетс 01801). Детектирование пика осуществляется монохроматично при длине волны 220-230 нм. Может быть проведен дополнительный анализ фракций, например с данными полихромного ультрафиолетового излучения, собранных с диодным системным детектором Уотерз 990 (фирма Миллипор Корпорэйшн, Хроматографический отдел Уотерз, 34 Мэпл Стрит, Милфорд, Массачузетс 01757). Выходящие из колонки фракции собирают известными методами, такими как с использованием коллектора фракций Ай-Эс-Си-Оу ("Фокси" и детектором пика Ай-Эс-Си-Оу 2159 /Ай-Эс-Си-Оу, 4700 Супериор, Линкольн, шт. Небраска 68504). Фракции собирают в сосуды подходящего размера, такие как стерильная полиэтиленовая лабораторная посуда. Затем осуществляется концентрирование этих фракций путем лиофилизации из элюента, с последующей лиофилизацией из воды. После этого определяется чистота полученных фракций компонентов методом хроматографического анализа с использованием аналитической колонки с градиентной системой, которая более изократичная, чем система, использованная на конечной стадии очистки фракций.
Последовательность полипептидов изобретения определяли в соответствии с известными методами. Общая стратегия определения первичной структуры включает, например, следующие стадии: 1) восстановление и пиридилирование по атому серы остатков цистеина, связанных дисульфидным мостиком, для того чтобы усилить восприимчивость субстрата к ферментативной атаке; 2) контролируемое расщепление пептида с помощью одно- или многостадийного ферментативного дигерирования; 3) выделение и очистка пептидных фрагментов методом жидкостной хроматографии высокого разрешения с обращенной фазой; 4) охарактеризовывание пептидных фрагментов с помощью N-терминального секвестирования и ион-распыляющей масс-спектрометрии.
Пиридилэтилирование по атому серы цистеиновых остатков изученных полипептидов может быть осуществлено, например, в растворе с последующим определением аминокислотной последовательности полипептидов. Одна такая методика S-пиридилэтилирования может быть осуществлена, как описано ниже.
Примерно от 1 до 10 мкг полипептида растворяют или разбавляют до объема 50 мкл буфером, приготовленным путем смешивания 1 части 1-молярного раствора реактива Трис HCl с pH 8,5, содержащего 4 ммоль/л этилендиаминтетрауксусной кислоты, и 3 частей 8-молярного раствора хлористоводородного гуанидина. Добавляют 2,5 мкл 10%-ного раствора 2-меркаптоэтанола, и смесь выдерживают при комнатной температуре в темноте в атмосфере аргона в течение 2 ч. После выдерживания добавляют 2 мкл 4-винилпиридина (свежий реактив, хранящийся под аргоном при -20oC), и смесь дополнительно выдерживают при комнатной температуре в темноте в атмосфере аргона в течение 2 ч. Затем смесь обессоливают предпочтительно с помощью короткой хроматографической колонки с обращенной фазой. Затем у выделенного алкилированного полипептида определяется последовательность аминокислот известными методами.
При практическом осуществлении этого изобретения и использовании изложенной выше общей методики было найдено, что подходящей колонкой для начального фракционирования яда является полупрепаративная колонка с полисульфоэтиловым эфиром амида аспарагиновой кислоты (Поли-Эл-Си 9,4x200 мм, 5 мкм). Эту колонку элюируют при скорости потока 3,5 мл/мин с использованием программы трехфазного линейного градиента, начиная с 20% B, 80% C и 0% D и заканчивая 20% B, 0% C и 80% D в течение 45 мин (B - ацетонитрил, C - 5 ммоль/л фосфорной кислоты в воде при pH 4,5, D=C+1-молярный раствор хлорида натрия), при детектировании при 220 нм. После этого целевые фракции могут быть дополнительно очищены, например с использованием жидкостной хроматографии высокого разрешения с колонкой обращенной фазы, такой как Си-18 Видак (300 ангстрем, 22x250 мм) при скорости потока 15 мл/мин с использованием программы двухфазного линейного градиента с 0,1% трифторуксусной кислоты и ацетонитрила, как изложено в примерах.
Получив выгоду из приведенного здесь описания в отношении пептидов, присутствующих во фракциях 10, 12, 13-1, 13-2, 13-3, 13-4 и 14-1, соответственно последовательности SEQID N 1 - 7 яда Filistata hibernalis, теперь стало возможно получать такие полипептиды другими методами, отличающимися от выделения/очистки цельного яда. Полипептиды этого изобретения могут быть получены с использованием методик рекомбинантной ДНК, посредством клонирования кодирующей последовательности указанных полипептидов или их частей. Например, могут применяться гибридизированные образцы, которые обеспечивают преимущество информации известной аминокислотной последовательности указанных полипептидов, в соответствии с методами, которые хорошо известны специалистам в области клонирования кодирующей последовательности всего полипептида. Для получения полипептидов этого изобретения также может быть использовано сочетание методик рекомбинантной ДНК и синтеза белка в организме. Такие способы синтеза белка в организме включают, но не ограничиваются, использование твердофазного пептидного синтетизатора Эй-Би-Ай 430А (фирма Эпплайд Байосистем, Инк. , 850 Линкольн Центер Драйв, Фостер сити, шт. Калифорния 94404) с использованием стандартной Меррифильдовской химии или другой твердофазной химии, которая хорошо известна специалистам в этой области биохимии.
В этой области биохимии хорошо известно, что в полипептидах могут быть сделаны определенные замещения аминокислот, которые не влияют или несущественно влияют на функцию указанных полипептидов. Возможные конкретные замещения изменяются в зависимости от вида полипептида. Определение допустимых замещений осуществляется по методикам хорошо известным специалистам в этой области. Таким образом, все полипептиды, имеющие практически такую же аминокислотную последовательность и существенно такую же активность блокирования кальциевых каналов, входят в объем защиты этого изобретения.
Полипептиды этого изобретения необратимо блокируют кальциевые каналы, присутствующие в разнообразных клетках, таких как клетки нервной и мышечной систем беспозвоночных и позвоночных.
Способность полипептидов этого изобретения блокировать кальциевые каналы демонстрируют с помощью следующей методики. Мозжечковые гранулярные клетки были приготовлены из мозжечка крыс 8-дневного возраста (Уилкин и др., Brain Res. 155, с. 181-199, 1976). Квадратики (1 см2) Аклара (фирма Пропластикс Инк. , 5033 Индастриэл авеню, Уолл, Нью-Джерси 07719) покрывают поли-L-лизином и помещают в чашку с 12 лунками, в которой содержится 1 мл основной среды Иглз. Клетки подвергают диссоциации, и в каждую лунку, содержащую квадратики Аклара, добавляют аликвоты, содержащие 6,25•106 клеток. Через 24 ч после посева добавляют цитозин-бета-D-арабинофуранозид в окончательной концентрации 10 мкмоль/л. Клетки используют для фура2-анализа на 6, 7 и 8 сутки культивации. Клетки, связанные с квадратиками Аклара, переносят в чашки с 12 лунками, содержащими 1 мл 2-микромолярного раствора фура2/АМ (фирма Молекуляр Проубз Инк., Юджин, Оу-Ар 97402) в буфере HEPES, содержащем 0,01% белка бычьей сыворотки, 0,01% декстрозы при pH 7,4 (не содержащем магния). Клетки выдерживали 40 мин при 37oC; удаляли буферный раствор, содержащий фура2/АМ, и заменяли его 1 мл того же самого буфера, не содержащего фура2/АМ. В кварцевую кювету добавляют 2,0 мл буфера, предварительно подогретого до 37oC. Клетки на Акларе помещают в кювету и последнюю вставляют в термостатированный держатель (при 37oC), снабженный магнитной мешалкой, и измеряют флуоресценцию на флуоресцентном спектрофотометре (Байомедикал Инструмент Гроуп, Университет Пенсильвании). Сигналу флуоресценции дают стабилизироваться примерно в течение 2 мин. Затем в кювету добавляют 5-20 мкл исходного раствора исследуемого соединения в фосфатном буферном солевом растворе (ФБР, pH 7,4) при соответствующей концентрации. Калибровку сигналов флуоресценции и корректировку утечки фура2/АМ осуществляют с использованием методик, разработанных Неметом и др. в J. BioI Chem., т.262, с.5188, 1987, по завершении каждого испытания. Величина максимальной флуоресценции (Fмакс) определяется путем добавления 35 микромоль/л иономицина, а минимальное значение флуоресценции (Fмин) определяют при последующем добавлении 12 ммоль/л этилендиаминтетрауксусной кислоты, чтобы образовать хелатное соединение кальция. Используя изложенную выше методику, было показано, что блокирование кальциевых каналов исследуемым полипептидом происходит посредством уменьшения флуоресценции при добавлении целевого полипептида. Полипептиды этого изобретения обладают низкими значениями концентрации ингибирования на 50% (ИК50), включая величины при 0,3 нм., для блокирования кальциевых каналов с использованием этого испытания. Для сравнения два известных продажных антагониста кальциевых каналов, Нифедипин и Верапамил, имеют величины ИК50 соответственно 33 и 4800 наномоль (нм.).
Полипептиды этого изобретения являются полезными в качестве агентов, блокирующих кальциевые каналы, как таковые. Эти вещества сами по себе также являются полезными для подавления беспозвоночных паразитов и при лечении заболеваний и состояний, переносимых в клетках млекопитающих по кальциевым каналам, таких как ангина, гипертония, кардиомиопатия, наджелудочковая аритмия, аэзофогеальная ахалазия, преждевременные роды и заболевание Рейнауда. Кроме того, эти вещества являются полезными при изучении физиологии клеток, включая клетки нервной и мышечной систем, но не ограничиваясь ими.
Также в охвате этого изобретения находятся фармацевтически приемлемые соли полипептидов изобретения. Такие соли образуются по методикам, которые хорошо известны специалистам в этой области химии. Например, основные соли полипептидов могут быть приготовлены традиционными методами.
Когда полипептид этого изобретения предназначается для введения млекопитающему, оно может быть назначено одно или в сочетании с фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями в фармацевтической композиции согласно обычной фармацевтической практике. Эти полипептиды могут назначаться перорально или парентерально, причем парентеральный способ назначения является предпочтительным для полипептидов. Парентеральное введение включает внутривенное, внутримышечное, внутрибрюшное, подкожное и местное назначение.
Для перорального применения полипептида этого изобретения вещество может быть назначено, например, в виде таблеток или капсул, или в виде водного раствора, или суспензии. В случае таблеток для перорального применения обычно добавляются носители, которые обычно используются, включающие лактозу и кукурузный крахмал и смазывающий агент, такой как стеарат магния. Для перорального назначения в форме капсул полезными разбавителями являются лактоза и высушенный кукурузный крахмал. Когда для перорального использования требуются водные суспензии, активный компонент смешивается с эмульгирующими и суспендирующими агентами. По желанию могут быть добавлены некоторые подслащающие и/или отдушивающие агенты.
Для внутримышечного, внутрибрюшинного, подкожного и внутривенного использования обычно готовят стерильные растворы активного компонента, причем значение pH растворов должны быть соответственно установлено и забуферировано. Для внутривенного использования суммарная концентрация растворенных веществ должна регулироваться таким образом, чтобы препарат оказался изотоническим.
Когда полипептид этого изобретения или его соль используются для подавления беспозвоночных паразитов, этот полипептид вводится указанному беспозвоночному непосредственно или предоставляется в среду обитания этого беспозвоночного. Например, вещество этого изобретения может быть распылено в виде раствора на указанное беспозвоночное. Количество вещества, которое необходимо для подавления этого беспозвоночного, может изменяться в соответствии с беспозвоночным и окружающими условиями и будет определяться специалистом, применяющим это вещество.
Когда полипептид этого изобретения или его соль используются для исследования физиологии клеток, указанный полипептид вводится в клетки в соответствии с методами, которые хорошо известны специалистам в этой области биохимии. Например, указанный полипептид может быть введен в клетки в соответствующем физиологическом буфере. Для использования в таких исследованиях подходящая концентрация веществ этого изобретения составляет 100 мкмоль/л. Однако концентрация указанного полипептида в таких исследованиях может быть больше или меньше, чем 100 мкмоль/л. Это количество назначаемого вещества будет определяться специалистом в этой области биохимии в соответствии с хорошо известными методами.
Следующие примеры являются иллюстративными и не должны рассматриваться с целью ограничения объема этого изобретения.
Пример 1. Пептид 10.
A. Неочищенный яд паука Filistata hibernalis (DW, приблизительно 80 мкл) подают на полупрепаративную колонку с полисульфоэтиловым эфиром амида аспарагиновой кислоты (Поли-Эл-Си 9,4 х 200 мм, 5 мкм), которая работает с использованием программы трехфазного линейного градиента, начиная с 20% B, 80% C и 0% D и заканчивая 20% B, 0% C и 80% D в течение 45 мин (B - ацетонитрил, C - 5 ммоль/л фосфорной кислоты в воде при pH 4, 5 и D = C + одномолярный раствор хлорида натрия), при детектировании при 220 нм. и скорости потока 3,5 мл/мин. Целевые фракции были собраны от 38,5 до 40-й минуты. Объединенные фракции были обессолены без концентрирования.
B. Материал с указанной выше стадии фракционирования A, произведенный исходя из 3360 мкл сырого яда, был подан в жидкостный хроматограф высокого разрешения на колонку с обращенной фазой (Си-18 Видак, 300 ангстрем, 22 х 250 мм) при скорости потока 15 мл/мин с использованием программы двухфазного линейного градиента от 80% A и 20 B до 56% A и 44%B в течение 42 мин (A - 0,1% трифторуксусной кислоты и B- ацетонитрил) с детектированием при 220 нм. Целевые фракции были собраны от 13 до 14 минуты. Объединенные желаемые фракции из индивидуальных опытов были концентрированы посредством лиофилизации.
Структура пептида 10 была определена и подтверждена следующими методами. Был проведен тройной аминокислотный анализ Пи-Ти-Си с 1 - 10 нмолями вещества с использованием системы Уотерз Пико-Таг. Определение N-терминальной последовательности аминокислот было проведено в приборе с импульсами жидкости (Эй-Би-Ай) как на естественном, так и на восстановленном/пиридилэтилированном пептиде. Данные масс-спектрометрического анализа были получены на ион-распыляющем масс-спектрометре SCI-EX API III.
Совокупность полученных данных подтверждает структуру пептида 10, которая показана ниже.
SEQ ID N1, 72 остатка, 12 цистеинов, 6 дисульфидных связей.
Рассчитанная масса = 8699,18.
Наблюдаемая масса = 8698,36 (ион-распыляющий масс-спектрометр).
Оценка p1 = 8,05.
Пример 2. Пептид 12.
A. Неочищенный яд паука Filistata hibernalis (DW, приблизительно 80 мкл) подают на полупрепаративную колонку с полисульфоэтиловым эфиром амида аспарагиновой кислоты (Поли-Эл-Си 9,4 х 200 мм, 5 мкм), которая работает с использованием программы трехфазного линейного градиента, начиная с 20% B, 80% C и 0% D и заканчивая 20% B, 0% C и 80% D в течение 45 минут (B - ацетонитрил, C - 5 ммоль/л фосфорной кислоты в воде при pH 4,5 и D = C + одномолярный раствор хлорида натрия), при детектировании при 220 нм и скорости потока 3,5 мл/мин. Целевые фракции были собраны от 32 до 33-й минуты. Объединенные фракции были обессолены без концентрирования.
B. Материал с указанной выше стадии фракционирования A, произведенный исходя из 3360 мкл сырого яда, был подан в жидкостный хроматограф высокого разрешения на колонку с обращенной фазой (Си-18 Видак, 300 ангстрем, 22 х 250 мм) при скорости потока 15 мл/мин с использованием программы двухфазного линейного градиента от 80% A и 20 B до 56% A и 44% B в течение 42 мин (A - 0,1% трифторуксусной кислоты и B - ацетонитрил) с детектированием при 22 нм. Целевые фракции были собраны от 16 до 17 минуты. Объединенные желаемые фракции из индивидуальных опытов были концентрированы посредством лиофилизации.
Структура пептида 12 была определена и подтверждена следующими методами. Был проведен тройной аминокислотный анализ Пи-Ти-Си с 1 - 10 нмолями вещества с использованием системы Уотерз Пико-Таг. Определение N-терминальной последовательности аминокислот было проведено в приборе с импульсами жидкости (Эй-Би-Ай) как на естественном, так и на восстановленном/пиридилэтилированном пептиде. Данные масс-спектрометрического анализа были получены на ион-распыляющем масс-спектрометре SCI-EX API III.
Пиридилэтилированная производная пептида 12, пригодная для определения N-терминальной аминокислотной последовательности, была приготовлена следующим образом. 100 мкг Пептида 12 растворяют в 10 мкл буфера (смесь 1 части одномолярного раствора реактива Трис с pH 8,4 и 4 мкмоль/л двухосновной этилендиаминтетрауксусной кислоты и 3 частей 8-молярного раствора хлористоводородного гуанидина) и обрабатывают 2,4 мкл 10%-го (1,41 молярного) раствора 2-меркаптоэтанола в буфере, и выдерживают при комнатной температуре в темноте в течение 3 ч. После этого реакционную смесь обрабатывают 3,7 мкл 0,93-молярного раствора 4-винилпиридина в буфере и выдерживают при комнатной температуре в темноте в течение 18 ч. Реакционную смесь разбавляют 184 мкл смеси 10% ацетонитрила в воде и подают на хроматографическую колонку ЖХВР (Бэйкер WPC-18, 4,6 х 250 мм), работающую при скорости потока 1,0 мл/мин с использованием программы двухфазного линейного градиента от 100 до 65% A и от 0 до 35% B в течение 30 мин и затем от 65 до 40% A и от 35 до 60% B в течение 15 мин (A - 0,1% трифторуксусной кислоты и B - ацетонитрил) при детектировании при 220 нм. Целевые фракции были собраны от 32,5 до 33,5 мин и сконцентрированы посредством лиофилизации. Примерный выход в расчете на аминокислотный анализ составил 82,36 мкг.
Совокупность полученных данных подтверждает структуру пептида 12, которая показана ниже.
SEQ ID N 2, 74 остатка, 12 цистеинов, 6 дисульфидных связей.
Рассчитанная масса = 8739,38.
Наблюдаемая масса = 8738,47+/-0,98 (ион-распыляющий масс-спектрометр).
Оценка pI = 8,20.
Пример 3. Пептид 13-1.
A. Неочищенный яд паука Filistata hibernalis (DW, приблизительно 80 мкл) подают на полупрепаративную колонку с полисульфоэтиловым эфиром амида аспарагиновой кислоты (Поли-Эл-Си 9,4 х 200 мм, 5 мкм), которая работает с использованием программы трехфазного линейного градиента, начиная с 20% B, 80% C и 0% D и заканчивая 20% B, 0% C и 80% D в течение 45 мин (B - ацетонитрил, C = 5 ммоль/л фосфорной кислоты в воде при pH 4,5 и D = C + одномолярный раствор хлорида натрия), при детектировании при 220 нм. и скорости потока 3,5 мл/мин. Целевые фракции были собраны от 34 до 35,5-й минуты. Объединенные фракции были обессолены без концентрирования.
B. Материал с указанной выше стадии фракционирования A, произведенный исходя из 3360 мкл сырого яда, был подан в жидкостный хроматограф высокого разрешения на колонку с обращенной фазой (Си-18 Видак, 300 ангстрем, 22 х 250 мм) при скорости потока 15 мл/мин с использованием программы двухфазного линейного градиента от 75% A и 25% B до 70% A и 30% B в течение 60 мин (A - 0,1% трифторуксусной кислоты и B - ацетонитрил) с детектированием при 220 нм. Целевые фракции были собраны от 25,5 до 28,5 минуты. Объединенные желаемые фракции из индивидуальных опытов были концентрированы посредством лиофилизации, давая смесь пептидов 13-1 и 13-2.
Структура пептида 13-1 была определена и подтверждена следующими методами. Был проведен тройной аминокислотный анализ Пи-Ти-Си с 1 - 10 нмолями вещества, с использованием системы Уотерз Пико-Таг. Определение N-терминальной последовательности аминокислот было проведено на приборе с импульсами жидкости (Эй-Би-Ай) как на естественном, так и на восстановленном/пиридилэтилированном пептиде. Данные масс-спектрометрического анализа были получены на ион-распыляющем масс-спектрометре SCI-EX API III.
Пиридилэтилированная производная пептида 13-1, пригодная для определения N-терминальная аминокислотной последовательности, была приготовлена следующим образом. 150 мкг Пептида 13-1 растворяют в 10 мкл буфера (смесь 1 части одномолярного раствора Трис, pH 8,4 и 4 мкмоль/л двухосновной этилендиаминтетрауксусной кислоты и 3 частей 8-молярного раствора хлористоводородного гуанидина) и обрабатывают 3,65 мкл 10%-го (1,41 молярного) раствора 2-меркаптоэтанола в буфере, и выдерживают при комнатной температуре в темноте в течение 3 ч. После этого реакционную смесь обрабатывают 5,91 мкл 0,93-молярного раствора 4-винилпиридина в буферном растворе и выдерживают при комнатной температуре в темноте в течение 18 ч. Реакционную смесь разбавляют 280 мкл смеси 10% ацетонитрила в воде и подают на хроматографическую колонку ЖХВР (Бэйкер WPC-18, 4,6 х 250 мм), работающую при скорости потока 1,0 мл/мин с использованием программы двухфазного линейного градиента от 100 до 65% A и от 0 до 35% B в течение 30 мин и затем от 65 до 40% A и от 35 до 60% B в течение 15 мин (A - 0,1% трифторуксусной кислоты и B - ацетонитрил) при детектировании при 220 нм. Целевые фракции были собраны от 33 до 34,5 мин и сконцентрированы посредством лиофилизации. Примерный выход в расчете на аминокислотный анализ составил 79,4 мкг.
Из-за гомологичности пептидов 13-1 и 13-2 эти пептиды не были разделены путем ионного обмена или хроматографии на обращенной фазе. При первоначальном определении последовательности смеси найдено, что первые 50 аминокислот являются идентичными, что предполагает использование разложения пептида для завершения установления структуры. Переваривание смеси с Глу-Си с последующим определением последовательности аминокислот в оставшихся фракциях в сочетании с дополнительным перевариванием с трипсином в 0,1 молярной растворе хлористоводородного Трис и 1-молярной соляной кислоты при pH 8,5 и последующим масс-спектрометрическим анализом подтверждает структуру пептида 13-1, которая показана ниже.
SEQ ID N 3, 74 остатка, 12 цистеинов, 6 дисульфидных связей.
Рассчитанная масса = 8653,26.
Наблюдаемая масса = 8652,57 (ион-распыляющий масс-спектрометр).
Оценка pI = 7,65.
Пример 4. Пептид 13-2.
Структура фракции 13-2, была подтверждена, как описано выше в примере 3.
SEQ ID N 4, 74 остатка, 12 цистеинов, 6 дисульфидных связей.
Рассчитанная масса = 8660,29.
Наблюдаемая масса = 8678,64 (ион-распыляющий масс-спектрометр).
Оценка pI = 7,65.
Пример 5. Пептид 13-3.
A. Неочищенный яд паука Filistata hibernalis (DW, приблизительно 80 мкл) подают на полупрепаративную кислоту (Поли-Эл-Си 9,4 х 200 мм, 5 мкм), которая работает с использованием программы трехфазного линейного градиента, начиная с 20% B, 80% C и 0% D и до 20% B, 0% C и 80% D в течение 45 мин (B - ацетонитрил, C - 5 ммоль/л фосфорной кислоты в воде при pH 4,5 и D = C + одномолярный раствор хлорида натрия), при детектировании при 220 нм. и скорости потока 3,5 мл/мин. Целевая фракция была собрана от 34 до 35,5 минуты. Объединенные фракции были обессолены без концентрирования.
B. Материал с указанной выше стадии фракционирования A, произведенный исходя из 3360 мкл сырого яда, был подан в жидкостный хроматограф высокого разрешения на колонку с обращенной фазой (Си-18 Видак, 300 ангстрем, 22 х 250 мм) при скорости потока 15 мл/мин с использованием программы двухфазного линейного градиента от 75% A и 25% B до 70% A и 30% B в течение 60 мин (A - 0,1% трифторуксусной кислоты и B - ацетонитрил) с детектированием при 220 нм. Целевые фракции были собраны от 29 до 31 минуты. Объединенные желаемые фракции из индивидуальных опытов были концентрированы посредством лиофилизации.
Структура пептида 13-3 была определена и подтверждена следующими методами. Был проведен тройной аминокислотный анализ Пи-Ти-Си с 1 - 10 нмолями вещества с использованием системы Уотерз Пико-Таг. Определение N-терминальной последовательности аминокислот было проведено на приборе с импульсами жидкости (Эй-Би-Ай) как на естественном, так и на восстановленном/пиридилэтилированном пептиде. Данные масс-спектрометрического анализа были получены на ион-распыляющем масс-спектрометре SCI-EX API III.
Пиридилэтилированная производная пептида 13-3, пригодная для определения N-терминальной аминокислотной последовательности, была приготовлена следующим образом. 300 мкг Пептида 13-3 растворяют в 20 мкл буфера (смесь 1 части одномолярного раствора Трис, pH 8,4 и 4 мкмоль/л двухосновной этилендиаминтетрауксусной кислоты и 3 частей 8-молярного раствора хлористоводородного гуанидина) и обрабатывают 7,28 мкл 10%-го (1,41 молярного) раствора 2-меркаптоэтанола в буфере, и выдерживают при комнатной температуре в темноте в течение 3 ч. После этого реакционную смесь обрабатывают 11,19 мкл раствора (10 об. %) 4-винилпиридина в буферном растворе и выдерживают при комнатной температуре в темноте в течение 18 ч. Реакционную смесь разбавляют до 600 мкл 1% трифторуксусной кислоты в воде и подают на хроматографическую колонку ЖХВР (Бэйкер WPC-18, 4,6 х 250 мм), работающую при скорости потока 1,0 мл/мин с использованием программы двухфазного линейного градиента от 100 до 65% A и от 0 до 35% B в течение 30 мин и затем от 65 до 40% A и от 35 до 60% B в течение 15 мин (A - 0,1% трифторуксусной кислоты и B - ацетонитрил) при детектировании при 220 нм. Целевые фракции были собраны от 34 до 35 мин и сконцентрированы посредством лиофилизации. Примерный выход в расчете на аминокислотный анализ составил 194 мкг.
Совокупность полученных данных подтверждает структуру пептида 13-3, которая показана ниже.
SEQ ID N 5, 74 остатка, 12 цистеинов, 6 дисульфидных связей.
Рассчитанная масса = 8668,29.
Наблюдаемая масса = 8668 (ион-распыляющий масс-спектрометр).
Оценка pI = 7,65.
Пример 6. Пептид 13-4.
A. Неочищенный яд паука Filistata hibernalis (DW, приблизительно 80 мкл) подают на полупрепаративную колонку с полисульфоэтиловым эфиром амида аспарагиновой кислоты (Поли-Эл-Си 9,4 х 200 мм, 5 мкм), которая работает с использованием программы трехфазного линейного градиента, начиная с 20% B, 80% C и 0% D до 20% B, 0% C и 80% D в течение 45 мин (B - ацетонитрил, C - 5 ммоль/л фосфорной кислоты в воде при pH 4,5 и D = C + одномолярный раствор хлорида натрия), при детектировании при 220 нм. и скорости потока 3,5 мл/мин. Целевые фракции были собраны от 34 до 35,5 минуты. Объединенные фракции были обессолены без концентрирования.
B. Материал с указанной выше стадии фракционирования A, произведенный исходя из 3360 мкл сырого яда, был подан в жидкостный хроматограф высокого разрешения на колонку с обращенной фазой (Си-18 Видак, 300 ангстрем, 22 х 250 мм) при скорости потока 15 мл/мин с использованием программы двухфазного линейного градиента от 75% A и 25% B до 70% A и 30% B в течение 60 мин (A - 0,1% трифторуксусной кислоты и B - ацетонитрил) с детектированием при 220 нм. Целевая фракция была собрана от 22 до 22,5 минуты. Объединенные желаемые фракции из индивидуальных опытов были концентрированы посредством лиофилизации.
Структура пептида 13-4 была определена и подтверждена следующими методами. Был проведен тройной аминокислотный анализ Пи-Ти-Си с 1 - 10 нмолями вещества, с использованием системы Уотерз Пико-Таг. Определение N-терминальной последовательности аминокислот было проведено в приборе с импульсами жидкости (Эй-Би-Ай) как на естественном, так и на восстановленном/пиридилэтилированном пептиде. Данные масс-спектрометрического анализа были получены на ион-распыляющем масс-спектрометре SCI-EX API III.
Совокупность полученных данных подтверждает структуру пептида 13-4, которая показана ниже.
SEQ ID N 6, 72 остатка, 12 цистеинов, 6 дисульфидных связей.
Рассчитанная масса = 8640,15.
Наблюдаемая масса = 8640 (ион-распыляющий масс-спектрометр).
Оценка pI = 7,87.
Пример 7. Пептид 14-1.
A. Неочищенный яд паука Filistata hibernalis (DW, приблизительно 80 мкл) подают на полупрепаративную колонку с полисульфоэтиловым эфиром амида аспарагиновой кислоты (Поли-Эл-Си 9,4 х 200 мм, 5 мкм), которая работает с использованием программы трехфазного линейного градиента, начиная с 20% B, 80% C и 0% D и до 20% B, 0% C и 80% D в течение 45 мин (B - ацетонитрил, C = 5 ммоль/л фосфорной кислоты в воде при pH 4,5 и D = C + одномолярный раствор хлорида натрия), при детектировании при 220 нм и скорости потока 3,5 мл/мин. Целевая фракция была собрана от 28 до 29 минуты. Объединенные фракции были обессолены без концентрирования.
B. Материал с указанной выше стадии фракционирования A, произведенный исходя из 3360 мкл сырого яда, был подан в жидкостный хроматограф высокого разрешения на колонку с обращенной фазой (Си-18 Видак, 300 ангстрем, 22 х 250 мм) при скорости потока 15 мл/мин с использованием программы двухфазного линейного градиента от 80% A и 20% B до 56% A и 44% B в течение 42 мин (A - 0,1% трифторуксусной кислоты и B - ацетонитрил) с детектированием при 220 нм. Целевую фракцию собирали от 18 до 19,5 минуты. Объединенные желаемые фракции из индивидуальных опытов были концентрированы посредством лиофилизации.
Структура пептида 14-1 была определена и подтверждена следующими методами. Был проведен тройной аминокислотный анализ Пи-Ти-Си с 1 - 10 нмолями вещества с использованием системы Уотерз Пико-Таг. Определение N-терминальной последовательности аминокислот было проведено на приборе с импульсами жидкости (Эй-Би-Ай) как на естественном, так и на восстановленном/пиридилэтилированном пептиде. Данные масс-спектрометрического анализа были получены на ион-распыляющем масс-спектрометре SCI-EX API III.
Пиридилэтилированная производная пептида 14-1, пригодная для определения N-терминальной аминокислотной последовательности, была приготовлена следующим образом. 150 мкг Пептида 14-1 растворяют в 10 мкл буфера (смесь 1 части одномолярного раствора Трис, pH 8,4 и 4 мкмоль/л двухосновной этилендиаминтетрауксусной кислоты и 3 частей 8-молярного раствора хлористоводородного гуанидина) и обрабатывают 3,65 мкл 10%-го (1,41 молярного) раствора 2-меркаптоэтанола в буфере, и выдерживают при комнатной температуре в темноте в течение 3 ч. После этого реакционную смесь обрабатывают 5,91 мкл 0,93-молярного раствора 4-винилпиридина в буферном растворе и выдерживают при комнатной температуре в темноте в течение 18 ч. Реакционную смесь разбавляют 280 мкл смеси 10% ацетонитрила в воде и подают на хроматографическую колонку ЖХВР (Бэйкер WPC-18, 4,6 х 250 мм), работающую при скорости потока 1,0 мл/мин с использованием программы двухфазного линейного градиента от 100 до 65% A и от 0 до 35% B в течение 30 мин и затем от 65 до 40% A и от 35 до 60% B в течение 15 мин (A - 0,1% трифторуксусной кислоты и B - ацетонитрил) при детектировании при 220 нм. Целевая фракция была собрана от 33 до 34,5 мин и сконцентрирована посредством лиофилизации.
Последовательность этого пептида была надежно определена вплоть до остатка 52. Восстановленный и пиридилэтилированный пептид (20 мкг) был переварен с 2 мкг эндопротеиназы Лиз-Си в 25 ммоль/л хлористоводородного Трис, 1 ммоль/л этилендиаминтетрауксусной кислоты при pH 8,5. Характеризация путем определения последовательности и ион-распыляющей масс-спектрометрометрией обеспечивает полную первичную структуру пептида 14-1, которая показана ниже.
SEQ ID N 7, 73 остатка, 10 цистеинов, 5 двойных связей.
Рассчитанная масса = 8308,05.
Наблюдаемая масса = 8307,67+/-0,55 (ион-распыляющий масс-спектрометр).
Оценка pI = 8,17.
Список последовательностей
1. Общая информация
1.1 Заявитель:
A/ Наименование: фирма Пфайзер Инк.
B/ Улица: 235 Ист 42-я Стриит
C/ Город: Нью-Йорк
D/ Штат: Нью-Йорк
E/ Страна: США
F/ Почтовый код /ZIP/: 10017
G/ Телефон: /203/ 441 - 4905
H/ Телефакс: /203/ 441 - 5221
A/ Наименование: фирма Эн-Пи-Эс Фармасьютикалз, Инк.
B/ Улица: 420 Чайпета Вэй
C/ Город: Солт Лэйк Сити
D/ Штат: Ута
E/ Страна: США
F/ Почтовый код /ZIP/: 84108
G/ Телефон: /801/ 583-4939
H/ Телефакс: /801/ 583-4961
1.2. Название изобретения: полипептиды из Filistata hibernalis, блокирующие кальциевый канал
1.3. Количество последовательностей: 7
1.4. Форма, читаемая на компьютере:
A/ Тип среды: Флоппи диск
B/ Компьютер: совместимый с Ай-Би-Эм Пи-Си
C/ Рабочая система: Пи-Си-ДОС/Эм-Эс-ДОС
D/ Программное обеспечение: Публикация Патент-Ин N 1.0, версия N 1.25 /И-Пи-Оу/
1.6. Данные о предшествующей заявке:
A/ Номер заявки: US 07/887073
B/ Дата регистрации: 21 мая 1992 г.
2. Информация для SEQ ID N 1:
2.1. Характеристика последовательности:
A/ Длина: 72 аминокислоты
B) Тип: аминокислота.
C) Витковость: единственная.
D) Топология: линейная.
2.2. Молекулярный тип: белок.
2.6. источник происхождения:
A) Организм: Filistata hibernalis.
F) Тип ткани: яд.
2.11. Описание последовательности SEQ ID N1, приведенной в конце описания.
2. Информация для SEQ ID N2:
2.1. Характеристика последовательности:
A) Длина: 74 аминокислоты.
B) Тип: аминокислота.
C) Витковость: единственная.
D) Топология: линейная.
2.2. Молекулярный тип: белок.
2.6. Источник происхождения:
A) Организм: Filistata hibernalis.
F) Тип ткани: яд.
2.11. Описание последовательности SEQ ID N 2 (см. в конце описания).
2. Информация для SEQ ID N 3:
2.1 Характеристика последовательности:
A) Длина: 74 аминокислоты.
B) Тип: аминокислота.
C) Витковость: единственная.
D) Топология: линейная.
2.2 Молекулярный тип: белок.
2.6. Источник происхождения:
A) Организм: Filistata hibernalis.
F) Тип ткани: яд.
2.11. Описание последовательности SEQ ID N 3 (см. в конце описания).
2. Информация для SEQ ID N 4:
2.1 Характеристика последовательности:
A) Длина: 74 аминокислоты
B) Тип: аминокислота
C) Витковость: единственная
D) Топология: линейная
2.2. Молекулярный тип: белок
2.6. Источник происхождения:
A) Организм: Filistata hibernalis
F) Тип ткани: яд
2.11. Описание последовательности SEQ ID N 4 (см. в конце описания).
2. Информация для SEQ ID N 5:
2.1. Характеристика последовательности:
A) Длина: 74 аминокислоты
B) Тип: аминокислота
C) Витковость: единственная
D) Топология: линейная
2.2. Молекулярный тип: белок
2.6. Источник происхождения:
A) Организм: Filistata hibernalis
F) Тип ткани: яд
2.11. Описание последовательности SEQ ID N 5 (см. в конце описания).
2. Информация для SEQ ID N 6:
2.1. Характеристика последовательности:
A) Длина: 72 аминокислоты
B) Тип: аминокислота
C) Витковость: единственная
D) Топология: линейная
2.2 Молекулярный тип: белок
2.6. Источник происхождения:
A) Организм: Filistata hibernalis
F) Тип ткани: яд
2.11. Описание последовательности SEQ ID N 6 (см. в конце описания).
2. Информация для SEQ ID N 7:
2.1. Характеристика последовательности:
A) Длина: 73 аминокислоты.
B) Тип: аминокислота.
C) Витковость: единственная.
D) Топология: линейная.
2.2. Молекулярный тип: белок.
2.6. Источник происхождения:
A) Организм: Filistata hibernalis.
F) Тип ткани: яд.
2.11. Описание последовательности SEQ ID N 7 (см. в конце описания).
Полипептиды, выделенные из яда паука Filistata hibernalis, блокируют кальциевые каналы в клетках различных организмов и являются полезными при блокировании кальциевых каналов в клетках как таковых, при лечении заболеваний и состояний, передаваемых по кальциевым каналам, и при подавлении беспозвоночных паразитов. 8 с.п. ф-лы.
| US, патент N 4597967, кл | |||
| Способ восстановления хромовой кислоты, в частности для получения хромовых квасцов | 1921 |
|
SU7A1 |
| US, патент N 4687839, кл | |||
| Способ восстановления хромовой кислоты, в частности для получения хромовых квасцов | 1921 |
|
SU7A1 |
