СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ ИММУННЫХ КОМПЛЕКСОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/539 

Изобретение относится к иммунологии.

Аналогами данного изобретения являются методы осаждения (преципитации) циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) из сыворотки крови полиэтиленгликолем-6000 (ПЭГ) и последующего исследования полученных преципитатов с помощью иммуноанализа (L. Hudson, F.C. Hay. Handbook of Practical Immunology, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1nd edition, 1980).

Прототипом изобретения является авт. св. СССР N 1681261, кл. G 01 N 33/53, 1991, в котором иммунные комплексы осаждают из биологической жидкости - грудного молока - добавлением 2%-ного раствора ПЭГ-6000 при объемном соотношении 1:1.

Признаками прототипа, совпадающими с существенными признаками изобретения являются: определение ЦИК в биологической жидкости; осаждение ЦИК из исследуемой жидкости с помощью 2%-ного раствора ПЭГ-6000.

Недостатком прототипа является относительно большой объем биологической жидкости, необходимый для осаждения ЦИК. При уменьшении объема исследуемой жидкости необходимо соответственно уменьшать и объем раствора ПЭГ. Но при этом резко увеличивается погрешность метода, т.к. раствор ПЭГ обладает значительной вязкостью и отмерить несколько микрометров такого раствора с помощью микропипетки очень трудно. Это является серьезным ограничением для применения прототипа в тех случаях, когда объем исследуемой биологической жидкости заведомо мал, например при определении ЦИК в сыворотке крови у детей, когда невозможно забрать достаточное количество крови.

Изобретение направлено на решение следующей задачи - определение ЦИК в малых объемах сыворотки крови. Для этого предлагается добавлять к исследуемой биологической жидкости 2%-ный раствор ПЭГ-6000 при объемном соотношении соответственно 1:17.

Для определения ЦИК к 10 мкл сыворотки добавляют 170 мкл 2%-ного раствора ПЭГ-6000. Осадок центрифугируют, промывают и ресуспендируют в 1,8 мл фосфатного буфера. По 100 мкл ресуспендированного осадка вносят в лунки полистиролового планшета, на стенках которых предварительно адсорбированы антитела, специфичные к определяемому иммуноглобулину G или M, или A. После инкубации в течение 2 ч лунки промывают и вносят в них по 100 мкл меченных пероксидазой хрена антител к иммуноглобулину G или M, или A соответственно. После инкубации в течение 1 ч и отмывания лунок в них вносят по 100 мкл стандартного раствора хромогена (3,25 мл 0,2 М фосфатного буферного раствора, 3,05 мл 0,1 М лимонной кислоты, 4 мг ортофенилендиамина, 18 мкл 30%-ной перекиси водорода и 12,5 мл дистиллированной воды). Через 5 - 15 мин добавляют в лунки по 50 мкл 1H соляной кислоты. Просчитывают на фотометре с вертикальным лучом оптическую плотность при длине волны 492 нм, по которой с помощью калибровочной кривой (по стандартным образцам с заранее известными концентрациями иммуноглобулина G или M, или A) определяют содержание соответствующего иммуноглобулина.

Способ предназначен для определения циркулирующих иммунных комплексов в биологической жидкости и может быть использован в иммунологии. Из исследуемой пробы биологической жидкости циркулирующие иммунные комплексы осаждают 2%-ным раствором полиэтиленгликоля-6000. В качестве биологической жидкости исследуют сыворотку крови, а 2%-ный раствор ПЭГ-6000 берут в объемном соотношении к исследуемой пробе сыворотки крови 17 : 1 соответственно. Способ позволяет определять циркулирующие иммунные комплексы в малых объемах сыворотки крови.

Способ определения циркулирующих иммунных комплексов в биологической жидкости, включающий осаждение их 2%-ным раствором полиэтиленгликоля-6000 (ПЭГ-6000), отличающийся тем, что в качестве биологической жидкости исследуют сыворотку крови, а 2%-ный раствор ПЭГ-6000 берут в объемном соотношении к исследуемой пробе сыворотки крови 17 : 1 соответственно.