СПОСОБ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА АНТИТЕЛ К ХИМИЧЕСКИМ КАНЦЕРОГЕНАМ ГРУППЫ ПОЛИЦИКЛИЧЕСКИХ АРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/573 

Область техники, к которой относится изобретение - иммунология, онкология, экология.

Уровень техники. Аналогами заявляемого изобретения являются твердофазные иммуноферментные методы гетерогенного анализа антител типа ELISA, включающие в себя: 1) адсорбцию антигена на стенках лунок пластиковых планшетов; 2) инкубацию исследуемой биологической жидкости с адсорбированными антигенами; 3) выявление антител, связавшихся с антигеном, с помощью анти-антител, меченых ферментом (Иммуноферментный анализ. Под ред. Т.Т. Нго, Г. Ленхоффа. М. Мир, 1988, 644 с.).

Прототипом заявляемого изобретения является метод, описанный J. L. Chagnaud, S. Faiderbe, M. Geffard (dentification and immunochemical characterization of Ig A in sera of patients with mammary tumors. - Int. J. Cancer, 1992, v. 50, p. 395-401). Согласно методу J.L. Chagnaud с соавт. в качестве антигена на стенках лунок пластикового планшета адсорбируют конъюгат бенз(а)пирена с тиреоглобулином в концентрации 64 мкг/мл. Анализ антител к бенз(а)пирену выполняют аналогично схеме, описанной выше. Т.е. вносят в лунки планшета с адсорбированным на стенках антигеном исследуемую сыворотку в разведении 1:1000, удаляют несвязавшиеся иммуноглобулины исследуемой сыворотки многократным отмыванием лунок планшета; вносят в лунки антитела к иммуноглобулинам человека, меченые пероксидазой хрена; удаляют несвязавшиеся меченые ферментом анти-иммуноглобулины многократным отмыванием лунок планшета; определяют количество связавшихся со стенками меченых ферментом анти-иммуноглобулинов (а стало быть и связавшихся с антигеном антител человека в исследуемой сыворотке) по интенсивности цветной реакции после добавления субстрата и хромогена. Для контроля неспецифического связывания антител исследуемой сыворотки с белком-носителем в отдельных лунках планшета адсорбируют белок-носитель без гаптена, в данном случае - без бенз(а)пирена.

Признаками прототипа, совпадающими с существенными признаками заявляемого изобретения являются: 1) использование в качестве антигена, адсорбированного на стенках лунок пластикового планшета, конъюгата гаптена с белком-носителем; 2) использование белка-носителя без гаптена в качестве контроля неспецифического связывания исследуемых антител; 3) общая схема выполнения метода - инкубация разведенной исследуемой сыворотки в лунках планшета, на стенках которых адсорбированы антигены; выявление связавшихся с антигенами антител исследуемой сыворотки с помощью анти-иммуноглобулиновых антител, меченых ферментом; определение связавшихся меченых анти-иммуноглобулиновых антител по интенсивности цветной ферментативной реакции.

Недостатками прототипа являются: 1) использование в качестве гаптена нативных молекул канцерогена, что сопряжено с риском для здоровья изготовителя и исследователя, выполняющего данный метод, за счет высокой канцерогенной опасности; 2) использование тиреоглобулина в качестве белка-носителя в ряде случаев может сопровождаться высоким неспецифическим связыванием антител исследуемой сыворотки не с гаптеном, а с белком-носителем (известны, например, целые группы заболеваний человека, характеризующиеся образованием ауто-антител к тиреоглобулину), что существенно ограничивает возможность метода; 3) большой расход антигена при подготовке тест-системы к выполнению метода - для адсорбции антиген вносили в лунки планшета в концентрации 64 мкг/мл.

Сущность изобретения.

Заявляемое изобретение направлено на решение следующих задач: 1) снижение канцерогенной опасности для здоровья исследователя и изготовителя тест-систем; 2) снижение неспецифического связывания антител исследуемой сыворотки с белком-носителем; 3) повышение экономичности метода.

Предлагаются следующие технические решения перечисленных задач:
1) Использовать в качестве гаптена не нативные канцерогены, а, в отличие от прототипа, их химические аналоги, не обладающие канцерогенной активностью, либо со значительно сниженной канцерогенной активностью. Для канцерогенов группы полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) такими соединениями являются их аналоги, имеющие заместители в бэй-области (в положении "5" фенантренового фрагмента). Заместитель, введенный в положение "5" фенантренового фрагмента, препятствует окислению ПАУ в бэй-области и образованию диолэпоксидов, являющихся активными формами канцерогенов ПАУ (Турусов В.С., Кобляков В.А. Стадийность канцерогенеза и механизмы действия химических канцерогенов. Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Онкология, 1986, т. 15, с. 6-75). Введение заместителей в бэй-область не изменяет антигенных свойств молекулы исходного канцерогена, т. к. при иммунизации замещенной формой ПАУ в качестве гаптена образуются антитела, перекрестно реагирующие со многими представителями группы ПАУ (F.L.Moolten, N.J.Capparell, E.Boger, P. Mahathalang. Induction of antibodies against Carcinogenic polycyclic aromatic hydrocarbons. - Nature, 1978, v. 272, N 13, p. 614-616). Поэтому замещенные в бэй-области аналоги ПАУ, не обладая канцерогенной опасностью для здоровья и сохраняя антигенные свойства исходного канцерогена, вполне могут служить в качестве гаптена в составе антигена в методах и тест-системах для анализа антител к химическим канцерогенам группы ПАУ.

2) Для снижения неспецифического связывания антител исследуемой сыворотки использовать в качестве белка-носителя альбумин, который в отличие от тиреоглобулина обладает меньшей антигенной и иммуногенной активностью и повсеместно используется в иммуно-анализах для блокирования неспецифического связывания антител с пластиком планшетов или других твердых носителей антигенов (Иммуноферментный анализ. Под ред. Т.Т.Нго, Ленхоффа. М. Мир; 1988, 466 с.). Растворами альбумина разводят сыворотку перед иммуноанализом антител (в т.ч. в прототипе буферный раствор, содержащий 1 г/л бычьего сывороточного альбумина, применяли для разведения исследуемой сыворотки).

3) Повышение экономичности метода достигается за счет снижения концентрации антигена при адсорбции его на поверхность лунок планшета. За счет высокой адсорбционной активности альбумина, который используется в настоящем предложении в качестве белка-носителя, оптимальная концентрация антигенов при адсорбции по заявляемому способу составляет 2 мкг/мл, что в 32 раза меньше, чем в прототипе (64 мкг/мл).

Таким образом существенными признаками заявляемого изобретения, отличительными от наиболее близкого аналога (прототипа) и обеспечивающими получение технического результата, являются:
1) Использование в качестве гаптена химических аналогов ПАУ, имеющих заместители в положении "5" фенантренового фрагмента молекулы ПАУ (в бэй-области);
2) Использование в качестве белка-носителя альбумина;
3) Снижение концентрации конъюгатов ПАУ - белок-носитель при адсорбции на стенки лунок планшетов до 2 мкг/мл;
Перечень фигур чертежей и иных материалов:
Фиг. 1. Схема иммуноанализа антител к ПАУ.

Фиг. 2. Кинетика адсорбции антигена на пластике.

Фиг. 3. Схема внесения антигенов и исследуемой жидкости в лунки планшета.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения Синтез конъюгата "ПАУ-Белок"
Синтез конъюгата "ПАУ-Белок" выполняли в полном соответствии с методом, описанным Moolten F.L. et al (Nature, 1978, v. 272, N 13, p. 614-616). 50 мг фторметилбензантрил уксусной кислоты (ФМБА) конъюгировали с 270 мг человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) опосредованно через образование смешанного ангидрида с изобутилхлоркарбонатом.

Ход анализа
1. Адсорбция антигенов. ЧСА (1) и ФМБА-ЧСА (2) растворяли в HO (концентрация 2 мкг/мл) и вносили по 100 мкл в лунки полистиролового 96-луночного планшета (на фиг. 1 и 3 соответственно ряды А, В и Б, Г). Инкубировали при 37^oC в течение 60 мин. Для выбора оптимальных условий адсорбции антигена на пластике инкубировали ФМБА-ЧСА по 100 мкл на лунку в концентрациях 0,5; 1; 2,5; 5; 10; 25; 50 мкг/мл в течение 30, 60, 90, 120, 150, 180 минут. Блокировали незанятые участки пластика внесением раствора овальбумина в лунки планшета в концентрации 0,1% по 100 мкл на лунку в течение 30 минут по стандартным правилам ELISA. Для определения адсорбированного материала вносили в лунки по 100 мкл кроличьих антител к ЧСА, конъюгированных с пероксидазой хрена. После отмывки несвязавшихся меченых антител к ЧСА и добавления субстрата и хромогена в соответствии со стандартным методом ELISA определяли оптическую плотность. Графики, характеризующие кинетику связывания ФМБА-ЧСА с пластиком, представлены на фиг. 2. На рисунке видно, что оптимальной концентрацией для адсорбции антигенов на пластик является 2 мкг/мл, что в 32 раза меньше, чем в прототипе, а наиболее оптимальным временем адсорбции является 1-2 часа при температуре 37^oC.

Последующие этапы выполняли в полном соответствии с прототипом.

2. Несвязавшийся материал удаляли из лунок простым вытряхиванием.

3. Блокировали незанятые участки пластика внесением 0,1% раствора овальбумина в лунки планшета по 100 мкл/лунку на 30 минут.

4. После удаления блокирующего раствора вносили в лунки исследуемую сыворотку человека, разведенную 1:1000 0,1% раствором овальбумина (фиг. 3) и инкубировали планшет в течение 2 часов при 18^oC. Каждый образец исследуемой сыворотки вносили в 3 лунки А и в 3 лунки Б. В лунки В и Г для определения фонового связывания с антигенами меченых пероксидазой анти-антител (5) вносили 0,1% раствор овальбумина.

5. Удаляли несвязавшиеся антитела путем 10-кратного отмывания лунок забуференной дистиллированной водой с 0,02% Твин-20.

6. Для определения связавшихся с антигенами антител (3, 4) вносили в лунки антитела к иммуноглобулинам человека, конъюгированных с пероксидазой хрена (5), по 100 мкл на лунку и инкубировали при 18^oC в течение 1 часа.

7. Отмывали лунки так же, как в п.5.

8. Вносили в лунки по 100 мкл субстратного буферного раствора с хромогеном (3,25 мл 0,2 М фосфатного буферного раствора, 3,05 мл 0,1 М лимонной кислоты и 4 мг ортофенилендиамина, 18 мкл 30% перекиси водорода и доводим до 12,5 дистиллированной воды) на 1-5 минут при 18^oC.

9. Добавляли в лунки по 75 мкл 1 Н раствора HCl.

10. Оптическую плотность регистрировали на фотометре "Унискан" при 492 нм.

Подсчет результатов
Таким образом, для каждого планшета имеется по два значения неспецифического фонового связывания меченых ферментом анти-антител: с белком-носителем (лунка В) и с полным антигеном (лунка Г). Кроме того, для каждого из образцов исследуемой жидкости имеется тоже по два значения связывания искомых антител с антигенами: с белком-носителем (лунка А) и с полным антигеном (лунка Б). Для установления истинного связывания искомых антител с гаптеном (ПАУ) для каждого образца (X_n) выполняется следующий расчет:

где
А, Б, В и Г - соответствующие усредненные оптические плотности.

X_n показывает на сколько процентов превышает истинное связывание искомых антител с гаптеном по сравнению с фоновым связыванием их с белком-носителем. При этом учитывается и фоновое связывание меченых пероксидазой хрена анти-антител с гаптеном и с белком-носителем.

Способ относится к иммунологии, в частности онкологии. На стенках лунок пластикового планшета адсобируют антиген. Затем инкубируют исследуемую биологическую жидкость с адсорбированным антигеном. Проявляют связавшиеся с антигеном антитела с помощью анти-антител, меченых ферментов. При этом в качестве антигена используют конъюгат фторметилбензантрила уксусной кислоты с человеческим сывороточным альбумином при их массовом соотношении 1:5,4 соответственно, в концентрации 2 мкг/мл. Способ позволяет снизить неспецифическое связывание антител исследуемой биологической жидкости с белком-носителем, сократить расход антигена. Способ прост и экономичен. 3 ил.

Способ иммуноферментного анализа антител к химическим канцерогенам группы полициклических ароматических углеводородов, включающий адсорбцию антигена на стенках лунок пластикового планшета, инкубацию исследуемой биологической жидкости с адсорбированным антигеном, проявление связавшихся с антигеном антител с помощью анти-антител, меченых ферментом, отличающийся тем, что в качестве антигена используют конъюгат фторметилбензантрила уксусной кислоты с человеческим сывороточным альбумином при их массовом соотношении 1 : 5,4 соответственно в концентрации 2 мкг/мл.