СПОСОБ ИММУНОАНАЛИЗА АНТИГЕНОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/53 

Аналогами заявляемого изобретения являются твердофазные иммуноферментные методы гетерогенного анализа антигенов, включающие в себя:
1) адсорбцию первый антител, специфичных к искомому антигену, на твердой фазе (стенки лунок пластиковых планшетов, шариков, бусинок и т.п.);
2) инкубацию исследуемой биологической жидкости (например, сыворотки крови) с адсорбированными антителами;
3) выявление антигена, связавшегося с адсорбированным антителами, с помощью вторых антител, специфичных к искомому антигену и меченых ферментов (Иммуноферментный анализ. Под ред. Т.Т. Нго, Г. Ленхоффа, М. Мир, 1988, 644 с.).

Прототип заявляемого изобретения
является общепринятый метод иммуноферментного анализа опухолевых антигенов (маркеров). В качестве первых антител (адсорбированных на твердой фазе) и вторых антител (меченых ферментов) используются моноклональные антитела, специфичные к тому или иному антигену, ассоциированному с опухолью. Разные фирмы-изтоговители используют различные моноклональные антитела, специфичные к тем или иным антигенам, ассоциированными с опухолями. Мы использовали метод иммуноанализа антигена, ассоциированного с раком молочной железы (ВСА), разработанный фирмой "Диагнотех" (г. Москва).

Признаками прототипа, совпадающими с существенными признаками заявляемого изобретения,
являются: 1) использование антител, специфичных к ВСА, адсорбированных на твердой фазе; 2) инкубация материала, содержащего ВСА, с адсорбированными антителами, с помощью вторых антител, специфичных к ВСА и меченных пероксидазой хрена.

Недостатком прототипа
является возможность получения ложноотрицательного или заниженного результата. Количество опухолевого маркера, определенное с помощью прототипа, не всегда совпадает с истинным содержанием маркера в биологической жидкости. Главным ограничивающим фактором является наличие в крови (или другой биологической жидкости) пациента антител, специфичных к исследуемым антигенам (в том числе к опухолевым маркерам). Не касаясь причин наличия антител в биологической жидкости, отметим, что собственные антитела способны связываться с отдельными эпитопами исследуемого антигена. Т.е., собственные антитела способны конкурировать за связывание с искомым антигеном с первым (адсорбированными на твердой фазе) и вторыми (меченными ферментом) антителами, входящими в состав аналитических антител.

Если собственных антител пациента имеется значительное количество и все эпитопы на молекулах антигена "замаскированы" ими, то антигены становятся недоступными для антитела, используемых в аналитической тест-системе. В этом случае результат, полученный с помощью прототипа и других антигенов, будет ложно отрицательным. Если "замаскирована" только часть эпитопов, то результат будет заниженным. И в первом, и во втором случаях полученные результаты неверно отражают истинное содержание антигена в исследуемой жидкости, что приводит к диагностическим ошибкам.

Заявляемое изобретение направлено на решение следующей задачи - уменьшение количества ложноотрицательных и заниженных результатов иммуноанализа антигенов в биологических жидкостях.

Предлагается следующее техническое решение поставленной задачи. Перед инкубацией биологической жидкости с антителами, адсорбированными на твердой фазе, специфичными с искомому антигену, образец исследуемой жидкости обрабатывается раствором полиэтиленглоколя - 6000 (ПЭГ) по методу, описанному L. Hudson, F. Hay (Practical Immunology, Blackwell Scientific Publications, 1980, Second Edition, p. 227 - 228). Обработка ПЭГ приводит с осаждению иммунных комплексов, содержащих циркулирующий антиген, связанный с антителами. Избыток циркулирующих антител удаляется с надосадочной жидкостью. Ресуспендирование осадка в исходном объеме приводит к диссоциации комплексов антиген-антитело по законам термодинамики (Иммунология. Под ред. У. Пола. М.: Мир, 1989, т. 3, с. 5 - 89). В этом случае антиген становится более доступным антителам, входящим в состав аналитических тест-систем. Это подтвердили полученные нами данные.

Образцы сыворотки больных раком молочной железы обрабатывали раствором ПЭГ по следующей схеме. К 0,9 мл сыворотки добавляли 0,1 мл 20% ПЭГ-6000 в вероналовом буферном растворе с добавлением ЭДТА и перемешивали полученную смесь. После инкубации при 4^oC в течение ночи центрифугировали смесь при 3000 g и 4^oC в течение 20 мин. Недосадочную жидкость удаляли, осадок ресуспендировали 2%-ным раствором ПЭГ в том же буферном растворе, центрифугировали в тех же условиях и вновь удаляли надосадочную жидкость. Осадок ресуспендировали в фосфатном буферном растворе в исходном объеме (0,9 мл).

Образцы сыворотки крови, необработанные ПЭГ, одновременно исследовали на содержание антигена, ассоциированного с раком молочной железы (Breast Cancer Antigen - BCA) с помощью аналитических иммуноферментных тест-систем фирмы "Диагнотех" (г. Москва) в полном соответствии с рекомендациями фирмы.

У 12% больных анализ ВСА по прототипу не выявил искомого антигена в сыворотке. Использование заявляемого метода позволило выявить искомый антиген в 97% случае. Таким образом, использование заявляемого метода позволило выявить 10% ложноотрицательных результатов, т.е. уменьшить количество ложноотрицательных случаев в 4 раза. Кроме того, в 80% случаев результаты, полученные по прототипу, оказались ниже, чем при использовании заявляемого метода.

Сущность изобретения: до внесения биологической жидкости в аналитическую тест-систему, содержащую специфичные к искомому антигену антитела, эта биологи ческая жидкость обрабатывается полиэтиленгликолем-6000. В результате из нее выделяются иммунные комплексы, содержащие искомый антиген и аутологичные антитела. Избыток циркулирующих аутологичных антител удаляется. После ресуспевдирования осажденных иммунных комплексов в исходном объеме они диссоциируют, и антиген становится более доступным для антител, входящих в состав аналитической тест-системы.

Способ иммуноанализа антигенов в биологической жидкости, включающий инкубацию исследуемого образца с антителами, специфичными к искомому антигену, и проведение определения после удаления избытка антител, отличающийся тем, что в качестве исследуемого образца берут сыворотку больных раковыми и предраковыми заболеваниями, при этом осаждение ведут ПЭГ-6000 при 3000g в соотношении с образцом 1 : 9 и ресуспендируют осадок в исходном объеме образца.