СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ВЫСОКОАФФИННЫХ ПОЛИ- И МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ВОДОНЕРАСТВОРИМЫМ ГАПТЕНАМ Российский патент 1998 года по МПК A61K39/00 G01N33/53 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к методам иммунохимического определения гаптенов (ксенобиотиков) в образцах биологического происхождения и объектах окружающей среды, и может быть использовано для выявления высокоаффинных поли- и моноклональных антител к водонерастворимым поликонденсированным ароматическим и гетероциклическим соединениям.

Одной из важнейших характеристик аналитических систем является чувствительность. Чувствительность иммуноанализа ограничивается константой связывания специфических антител с антигеном, которая определяет минимальные концентрации иммунореагентов, при которых еще может образоваться иммунный комплекс. Таким образом, выявление высокоаффинных антител является важнейшим этапом разработки высокочувствительных иммуноаналитических систем.

Анализ антител к водонерастворимым гаптенам осложнен тем, что при переводе водонерастворимых гаптенов в водные растворы известными методами молекулы гаптена оказываются физически связанными друг с другом в составе водорастворимых комплексов. Получаемые характеристики связывания антител с такими водорастворимыми гаптеновыми комплексами не отражают реальных констант связывания антител, поскольку в связывании таких комплексов гаптена могут одновременно участвовать оба антигенсвязывающих участка антитела и молекулы гаптена в составе водорастворимых комплексов имеют совсем иные физические характеристики.

Известен твердофазный иммуноферментный способ выявления антител, включающий в себя приготовление белков-носителей с ковалентно присоединенным гаптеном, адсорбцию белкового носителя с ковалентно присоединенными молекулами гаптенов на твердой фазе (на стенках пробирок или иммунологических планшетов), инкубацию исследуемой пробы антител с адсорбированным антигеном, выявление антител, связанных с адсорбированным антигеном при помощи реагентов, применяемых для определения иммуноглобулинов (антивидоспецифические антитела, белок А и т.д.) [1]
Твердофазные иммуноаналитические методы позволяют выявлять антитела к анализируемым соединениям, однако, поскольку реакция взаимодействия антител с антигеном проходит не в растворе, а на твердой фазе, эти методы не позволяют определить реальные константы связывания антител и не пригодны для выявления высокоаффинных антител.

Наиболее близким к предлагаемому способу прототипом является способ выявления антител методом конкурентного твердофазного иммуноанализа, включающий следующие стадии [2] коньюгирование активированных производных гаптенов с белковым носителем и выделение модифицированных белков, адсорбцию белкового носителя с ковалентно присоединенными молекулами гаптенов на твердой фазе (на стенках пробирок или иммунологических планшетов) с последующей отмывкой не связавшегося с твердой фазой вещества, растворение гаптена в органическом растворителе, высушивание раствора на стенках пробирки и перевод гаптена в водорастворимый комплекс при помощи длительного озвучивания в растворе детергента, инкубацию исследуемой пробы антител с адсорбированным антигеном и различными концентрациями гаптена в виде водорастворимого комплекса с детергентом с последующей отмывкой от непрореагировавших компонентов, инкубацию с реагентами, визуализующими антитела, связанные с адсорбированным антигеном, определение концентрации специфичного иммунного комплекса путем детекции сигнала ферментативной реакции и вычисление константы связывания антител с антигеном.

Недостатком прототипа является то, что процесс растворения гаптена в водном растворе происходит путем встраивания водонерастворимого соединения в мицеллы детергента с формированием водорастворимого комплекса. После такого растворения в одной мицелле детергента, как правило, находится несколько молекул анализируемого вещества. Вследствие большого размера мицелл обе валентности антитела способны взаимодействовать с мицеллой, и такое взаимодействие не отражает реальную константу связывания. Кроме того, мицеллы сильно гетерогенны по размеру, встроенная в мицеллу детергента молекула обладает уже другими диффузионными характеристиками, что также не позволяет оценить реальную константу связывания антител.

Описанный способ выявления антител является многостадийным и характеризуется высокой трудоемкостью.

Технической задачей предлагаемого изобретения является упрощение способа выявления антител и обеспечение возможности выявлять высокоаффинные антитела к водонерастворимым гаптенам.

Поставленная задача решается предлагаемым способом выявления высокоаффинных поли- и моноклональных антител к водонерастворимым гаптенам путем инкубирования исследуемой пробы, содержащей антитела, с радиоактивномеченным олигонуклеотидом, предварительно конденсированным с соответствующим водонерастворимым поликонденсированным ароматическим или гетероциклическим соединением.

Предлагаемый способ заключается в следующем.

Радиоактивно меченный олигонуклеотид конденсируют с реакционноспособным производным водонерастворимого гаптена и выделяют продукт реакции - водорастворимый коньюгат известными методами.

Исследуемую пробу, содержащую антитела, инкубируют с раствором коньюгата.

Отделяют образовавшийся иммунный комплекс фракционированием полиэтиленгликолем и определяют концентрацию связанной фракции по радиоактивности осадка.

Использование предлагаемого способа позволяет определить реальную константу связывания антител с водонерастворимым гаптеном, поскольку реагирующие вещества находятся в неагрегированной форме в отличие от прототипа, где водонерастворимые гаптены встроены в мицеллы детергентов.

Предлагаемый способ содержит меньшее число стадий, каждая стадия занимает меньше времени, чем в прототипе и содержит меньшее количество операций, поэтому способ является более быстрым и менее трудоемким.

Кроме того, коньюгирование радиоактивномеченного олигонуклеотида с гаптеном существенно облегчает процедуру детекции иммунного комплекса и делает процедуру детекции более воспроизводимой, поскольку не используются дополнительные реагенты для выявления иммунного комплекса и отсутствует стадия ферментативной реакции, а измеряется напрямую физическая величина - радиоактивность, не зависящая от химического состава среды, температуры, и т.д.

Определяющим существенным отличием предлагаемого способа является предварительное конденсирование водонерастворимого гаптена с олигонуклеотидом, в результате чего получается водорастворимый коньюгат с мольным соотношением гаптен: олигонуклеотид, равным единице, способный реагировать с антителами, что позволяет упростить известный способ и обеспечить возможность выявления высокоаффинных антител к водонерастворимым гаптенам. При использовании соотношения гаптен: олигонуклеотид меньше единицы ухудшается чувствительность аналитической системы, поскольку только часть связывающегося с антителами гаптена оказывается радиоактивномеченной, а при соотношении гаптен:олигонуклеотид больше единицы молекулы гаптена оказываются физически связанными, связывание антителом одной молекулы антигена влияет на возможность узнавания антителами остальных молекул, кроме того, возникают сложности с растворением таких коньюгатов и определением степени модификации олигонуклеотида.

Ранее описанные способы не позволяют оценить реальных констант, так как реакция связывания идет в гетерофазной системе и наличие у антител двух центров связывания существенно увеличивает кажущуюся константу связывания антител.

В настоящее время описаны соединения олигонуклеотидов с некоторыми гетероциклическими и ароматическими соединениями, которые получают конденсированием активированных производных этих соединений с 5 концевым фосфатом через спейсеры, содержащие аминогруппы [3, 4] Однако такие модифицированные олигонуклеотиды ранее для выявления высокоаффинных антител не использовались. Описано лишь их использование для увеличения прочности комплементарного комплекса олигонуклеотида с матрицей.

Использование соединений олигонуклеотидов с водонерастворимыми поликонденсированными ароматическими и гетероциклическими соединениями для повышения растворимости соединений и представления водонерастворимых соединений антителам не является очевидным, поскольку из вышеописанных работ следует, что гидрофобная часть коньюгата находится в комплексе с азотистыми основаниями олигонуклеотидов, не экспонирована в раствор и, по-видимому, не способна взаимодействовать с антителами.

Таким образом, в связи с тем, что в известных научно-технических и патентных источниках сведений о заявляемом способе не обнаружено, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого технического решения критериям "новизна" и "изобретательский уровень".

Предлагаемое изобретение поясняется нижеприведенными примерами.

Получение коньюгатов олигонуклеотидов с водонерастворимыми поликонденсированными ароматическими и гетероциклическими соединениями.

Пример 1. Для синтеза коньюгата берут 1,6 О.Е. (50 мкг) очищенного электрофорезом в полиакриламидном геле шестнадцатизвенного олигонуклеотида с радиоактивным 5 концевым фосфатом и удельной радиоактивностью 0,5-1 mKu/О.Е.

Олигонуклеотид переводят в цетавлоновую соль. Для этого к 10 мкл раствора олигонуклеотида в дистиллированной воде добавляют 2 мкл 8%-ного раствора цетавлона, осаждают цетавлоновую соль олигонуклеотида центрифугированием, убирают супернатант, растворяют осадок в 50 мкл метанола и высушивают под вакуумом. Цетавлоновую соль олигонуклеотида растворяют в 50 мкл диметилсульфоксида (ДМСО), добавляют растворы трифенилфосфина (7,8 мг в 25 мкл ДМСО), дипиперидилдисульфида (6,6 мг в 25 мкл ДМСО) и 4,8 мкл N-метилимидазола. После инкубации в течение 10 мин при комнатной температуре в реакционную смесь добавляют 4 мкл триэтиламина, 5 мкл диаминопентана и инкубируют еще 15 мин. Олигонуклеотид с ковалентно присоединенным диамином осаждают 10 объемами ацетона с 2% LiCLO₄, отмывают ацетоном и высушивают. Сухой осадок растворяют в 2,5 мкл воды, добавляют 47,5 мкл диметилацетамида (ДМА), 30 мкл раствора 5-фтор-7-(N-гидроксисукцинимидил) карбоксиметил-12-метил-бенз[а] антрацена (2 мг/мл ДМА), 5 мкл триэтиламина и инкубируют 1 ч при комнатной температуре. Коньюгат переосаждают ацетоном с 2% LiCLO₄, отмывают ацетоном, высушивают и перерастворяют в 20 мкл воды. Коньюгат очищают электрофорезом в 20% -ном полиакриламидном геле с 7 M мочевиной в 50 мM трис-боратном буфере, pH 8,3. Коньюгат в геле выявляют по засвечиванию рентгеновской пленки, вырезают гель с коньюгатом и элюируют коньюгат на ДЭАЭ целлюлозу в 5 мM трис-боратном буфере, pH 8,3. Коньюгат смывают 2 M LiCLO₄, переосаждают ацетоном, высушивают и растворяют в 50 мкл воды. Исходя из удельной радиоактивности олигонуклеотида и радиоактивности раствора коньюгата вычисляют концентрацию коньюгата. Структуру полученных коньюгатов 5-фтор-7-карбоксиметил-12-ме тил-бенз[а] антрацена (ФМБА) с олигонуклеотидом подтверждали при помощи электрофореза в 20% -ном полиакриламидном геле в ТБЕ-буфере с 8 M мочевины (фиг. 1) и при помощи антител к ФМБА (фиг. 2). На фиг. 1. продемонстрировано изменение электрофоретической подвижности олигонуклеотида после присоединения диамина и ФМБА. На 1-й дорожке радиоафтографа отмечен исходный олигонуклеотид и продукты реакции исходного p(T)₁₆ с диамином NH₂(CH₂)₅NH₂, на 2-й дорожке продукты реакции аминопроизводного олигонуклеотида и N-оксисукцинимидного эфира ФМБА.

Пример 2. Для синтеза коньюгата берут 1,6 О.Е. (50 мкг), очищенного электрофорезом, в полиакриламидном геле шестнадцатизвенного олигонуклеотида с радиоактивным 5 концевым фосфатом и удельной радиоактивностью 0,5-1 mKu/О. Е. Коньюгат N-гидроксисукцинимидного эфира N-(3,7,8-трихлордибензо диокси нил-1)-адипаминовой кислоты с олигонуклеотидом синтезировали и выделяли так же, как и в примере 1. Образование коньюгата детектировали по появлению продукта с меньшей электрофоретической подвижностью (фиг. 3) и по способности коньюгата взаимодействовать с антителами к 1-N-(адипа мино)-3,7,8-трихлордибензодиоксину (ТХДД) (фиг. 4). На фиг. 3 представлен радиоафтограф геля (20% -ный акриламид, 8 M мочевина) после электрофореза продуктов, полученных на различных стадиях синтеза (ТХДД) NH(CH₂)₅NHp(T)₁₆. На 1-й дорожке нанесен исходный олигонуклеотид p(T)₁₆, на 2-й дорожке продукты реакции p(T)₁₆ с диамином NH₂(CH₂)₅NH₂, на 3-й дорожке продукты реакции аминопроизводного олигонуклеотида и N-оксисукцинимидного эфира ТХДД. Из фиг. 3 следует, что присоединение диамина происходит практически количественно, а N-оксисукцинимидный эфир ТХДД включается в состав коньюгата на 5-10% Концентрацию коньюгата определяли исходя из удельной радиоактивности исходного олигонуклеотида и радиоактивности коньюгата.

Пример 3. Выявление антител к ФМБА.

Мышей линии BALB/c иммунизировали бычьим сывороточным альбумином, предварительно модифицированным 5-фтор-7-(N-гидроксисукцинимидил) карбоксиметил-12-ме тил-бенз[а]антраценом. Для анализа готовят разведения иммунной и неиммунной сывороток в 100, 200, 400, 800, 1600 и 3200 раз буферным раствором 0,01 M трис/HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,05% твин 20 (ТБС). К 100 мкл разведения антисыворотки добавляют 100 мкл раствора коньюгата (разведение в 500 раз на ТБС) и в качестве контроля неспецифической сорбции к 100 мкл антисыворотки добавляют 100 мкл раствора исходного радиоактивномеченного олигонуклеотида с той же конечной концентрацией, что и коньюгат. Такие же раститровки ставят на неимунной сыворотке. После инкубации в течение 12 ч при комнатной температуре добавляют в каждую пробирку по 50 мкл раствора IgG человека (5 мг/мл) и 800 мкл 15%-ного раствора полиэтиленгликоля м.в. 6000 на воде. После центрифугирования сливают супернатант и определяют радиоактивность осадков на счетчике радиоактивности (RacBetta, LKB). На фиг. 2. представлена зависимость связывания коньюгата от концентрации антисыворотки. Из фигуры видно, что антитела неиммунной сыворотки мыши не связывают коньюгат, а для антисыворотки мыши, иммунизированной альбумином, модифицированным ФМБА, наблюдается типичная раститровочная кривая, что свидетельствует о том, что в состав коньюгата входит молекула ФМБА. Из раститровочной кривой определяют, что иммунная антисыворотка в разведении 1:400 связывает половину от максимального связывания коньюгата. В пробирки, содержащие 100 мкл антисыворотки, разведенной в 400 раз, добавляют по 100 мкл растворов коньюгата с конечной концентрацией 6, 3, 1,5, 0,75, 0,375 и 0,187 нмол. Для каждой концентрации коньюгата определяют неспецифическую сорбцию, инкубируя коньюгат с буфером без антисыворотки. После инкубации, осаждения и счета радиоактивности осадков определяют константу связывания антител равной 1,12 нмол (фиг. 5).

Пример 4. Выявление и определение констант связывания антител к 1-N-(адипа мино)-3,7,3-трихлордибензодиоксину (ТХДД).

Иммуноаналитические процедуры выполняли так же, как описано в примере 3. Для получения антисывороток мышей линии BALB/c иммунизировали коньюгатом N-гидроксисукцинимидного эфира N-(3,7,3 -трихлордибензодиокси нил-1)-адипаминовой кислоты с бычьим сывороточным альбумином. На фиг. 4 представлены раститровки иммунной и неиммунной антисывороток на коньюгате диоксина с олигонуклеотидом. Из раститровочных кривых следует, что антитела неиммунной сыворотки мыши не взаимодействуют с коньюгатом, а иммунная антисыворотка связывает коньюгат диоксина с олигонуклеотидом. Из раститровочной кривой определяют, что иммунная антисыворотка в разведении 1:800 связывает половину от максимального связывания коньюгата. По раститровке коньюгата на антисыворотке, разведенной в 800 раз, определяют константу связывания антидиоксиновых антител, равную 0,375 нмол (фиг. 6).

Источники информации.

1. Toxicol. Appl. Pharmacol, 50 (1979) 147.

2. Experimental Toxicology and Chemistry, 7, 859-870, 1988.

3. Journal of Molecular Recognition, vol. 7, 177-188 (1994).

4. Bioconjugate Chem. 3, 554-558 (1992).

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к методам иммунохимического определения гаптенов (ксенобиотиков) в образцах биологического происхождения и объектах окружающей среды, и может быть использовано для выявления высокоаффинных поли- и моноклональных антител к водонерастворимым гаптенам. Использование изобретения позволит упростить способ выявления антител и обеспечить возможность выявлять высокоаффинные антитела к водонерастворимым поликонденсированным ароматическим соединениям для их применения в высокочувствительных иммуноаналитических системах. Способ заключается в инкубировании исследуемой пробы, содержащей антитела, с радиоактивномеченным олигонуклеотидом, предварительно конденсированным с соответствующим водонерастворимым поликонденсированным ароматическим или гетероциклическим соединением общей формулы O-C-R, где R - соответствующее поликонденсированное ароматическое или гетероциклическое соединение, S - диаминоспейсер, O - радиоактивномеченный олигонуклеотид, при этом мольное соотношение O:C:R равно единице. 6 ил.

Способ выявления высокоаффинных поли- и моноклональных антител к водонерастворимым гаптенам путем инкубирования исследуемой пробы с антигеном, выделением полученного иммунного комплекса с последующей его детекцией, отличающийся тем, что в качестве антигена используют соответствующее водонерастворимое поликонденсированное ароматическое или гетероциклическое соединение, предварительно конденсированное с радиоактивномеченным олигонуклеотидом общей формулы O-S-R, где R соответствующее поликонденсированное ароматическое или гетероциклическое соединение, S - диаминоспейсер, O радиоактивномеченный олигонуклеотид, при этом мольное соотношение O R равно единице.