СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАРУШЕНИЯ ИММУННОГО СТАТУСА Российский патент 2005 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской иммунологии, и может быть использовано для определения нарушения иммунного статуса человека путем сопоставлении коэффициента эффекторной функции гетерофильных антител с относительным уровнем содержания циркулирующих иммунных комплексов.

Основная, первичная функция антител - связывание с антигеном, в некоторых случаях оно непосредственно ведет к достижению эффекта, обеспечивая нейтрализацию бактериального токсина или предотвращая проникновение вируса в клетки. Однако чаще взаимодействие антител с антигеном остается безрезультатным, пока они не осуществят свои вторичные, “эффекторные” функции [1].

К одной из эффекторных функций иммуноглобулинов относится их избирательное взаимодействие с различными типами клеток (мононуклеары, нейтрофилы, тучные клетки, базофилы) при участии специальных рецепторов клеточной поверхности (FcR) [1].

Другой важной эффекторной функцией IgM, IgG1, IgG2 и IgG3 после связывания с антигеном является активация классического пути системы комплемента (СК) [2]. Альтернативный и лектиновый пути активируются иммунными комплексами (ИК), содержащими IgA [3].

Система комплемента является частью иммунной системы и состоит из многих компонентов, которые действуют каскадным механизмом. Эта система играет ключевую роль как в клиренсе ИК, так и в иммунном ответе на инфекционные агенты, чужеродные антигены, опухолевые и вирус-инфицированные клетки.

Система комплемента может активироваться тремя путями (классический, альтернативный и лектиновый).

Классический путь является Са²⁺/Мg²⁺ - зависимым каскадом, который в норме активируется при формировании ИК. С1, первый ферментный комплекс в каскаде, является пентамолекулярным комплексом. Включает одну молекулу C1q и по две молекулы С1r и С1s. C1 компонент связывается с Fc-фрагментом иммуноглобулинов в ИК через C1q домен и инициирует ферментативный каскад комплемента. Как только активируется C1, С1s расщепляет компонент С4, приводя к образованию С4b, который затем связывает С2. Иммобилизованный компонент С2 расщепляется при помощи фермента С1s с образованием С3-конвертазы (С4b, С2а) классического пути.

Альтернативный путь является Mg²⁺ - зависимым и активируется рядом разнообразных веществ, включающих полисахариды клеточных стенок дрожжей и бактерий, определенные биополимерные материалы. При иммобилизации С3b на поверхности на него садится фактор В, который расщепляется фактором D и образуется С3-конвертаза (С3b, Bb) альтернативного пути.

Лектиновый путь активирует комплемент при помощи маннан-связывающего лектина (MBL) через две сывороточные протеазы (MASP-1 и MASP-2) (подобно с С1r и C1s в классическом пути активации комплемента). MBL связывается с клеточными стенками патогенов, содержащих маннозу. Как и в классическом пути активации комплемента, для пектинового пути также требуются компоненты С4 и С2. Активация лектинового пути приводит к формированию С3-конвертазы, аналогичной с С3-конвертазой классического пути (C4b, C2a) [1].

Субстратом С3-конвертазы трех путей является ключевой компонент комплемента С3, при гидролизе которого образуются С3а и С3b. Присоединяя дополнительно молекулу С3b, С3-конвертаза обретает способность гидролизовывать компонент С5, который запускает реакцию формирования мембраноатакующего комплекса (МАК).

При активации комплемента генерируются биологически активные фрагменты белков С3, С4 и С5 (С3а, С4а и С5а-анафилатоксины) и С5b-9 (МАК), которые опосредуют воспалительные активности, включающие лейкоцитарный хемотаксис, активацию макрофагов, нейтрофилов и тромбоцитов, тучных и эндотелиальных клеток, повышение сосудистой проницаемости, цитолиз и тканевое повреждение [4].

Дефицит компонентов классического пути активации комплемента –C1q, C1r и C1s, С4 или С2 - вызывает предрасположенность к заболеваниям, обусловленным нарушениями в формировании и клиренсе ИК, например к возникновению системной красной волчанки (СКВ). Также показано, что у больных с СКВ вдвое снижено количество рецепторов для С3b (CR1) на эритроцитах и лейкоцитах [1]. CR1 и Fc-рецепторы кооперируются для связывания и фагоцитоза опсонизированных частиц.

Недостаточность комплемента составляет не более 2% всех первичных иммунодефицитов, проявляется нарушением опсонизации, фагоцитоза и разрушения микроорганизмов и сопровождается тяжелыми инфекциями, вплоть до сепсиса [5].

Для исследования системы комплемента определяют его гемолитическую активность. Суть метода заключается в следующем: 1) разные разведения исследуемой сыворотки добавляют к эритроцитам барана, сенсибилизированным антителами кролика (ЕА_к); 2) степень гемолиза оценивают фотометрически по выходу гемоглобина в раствор. Активность комплемента выражают в гемолитических единицах. За одну 50% гемолитическую единицу комплемента (СН₅₀) принимают такое его количество, которое вызывает гемолиз 50% 0,5 мл стандартной суспензии ЕА при 37°С за 45 мин. В мл сыворотки здоровых доноров обычно содержится 20-40 СН₅₀ [6].

Однако существенным недостатком этого метода является использование анти-Форсмановских антител кролика для сенсибилизации эритроцитов барана, что ограничивает тест только гемолитической активностью комплемента. С этой точки зрения понятен интерес к способам определения эффекторной функции человеческих иммуноглобулинов, в частности по способности к активации собственного комплемента по классическому пути.

Существует метод определения титра гетерофильных антител (ГА) к эритроцитам барана с помощью реакции гемагглютинации при лабораторной диагностике инфекционного мононуклеоза (ИМ) (проба Пауля-Буннелля). ГА представляют собой IgM, взаимодействующие с антигенами животных неродственных видов, например барана или быка. Эти антитела выявляются примерно у 90% больных ИМ. ГА в низком титре могут присутствовать и у здоровых людей. ГА при ИМ отличаются от ГА, присутствующих в сыворотке здоровых и больных сывороточной болезнью, по способности абсорбироваться тканью почек морской свинки и эритроцитами быка. Диагностически значимым считается титр 1:128-1:256. Кроме инфекционного мононуклеоза проба бывает положительной при лейкозах, вирусных гепатитах, цитомегаловирусной инфекции, лимфоме Беркитта, ревматоидном артрите и после введения иммунных сывороток [5].

Однако проба Пауля-Буннелля характеризует способность ГА к гемагглютинации, но не отражает одну из эффекторных функций гетерофильных антител - способность активировать систему комплемента.

Таким образом, на настоящий момент не существует способа определения нарушений иммунного статуса, включающего комплексный анализ титра гетерофильных антител, их комплементактивирующих свойств и относительного уровня циркулирующих иммунных комплексов.

Задачей настоящего изобретения является расширение ассортимента способов лабораторной диагностики иммунодефицитов, аутоиммунных и аллергических заболеваний, злокачественных новообразований.

Поставленная задача решается путем забора крови у пациента, получения из нее сыворотки и определения в сыворотке крови сначала титра гетерофильных антител по методу Пауля-Буннелля, затем относительного уровня циркулирующих иммунных комплексов методом преципитации ПЭГ 6000 и комплементактивирующих свойств гетерофильных антител путем инкубации стандартизированных эритроцитов барана (1,5×10⁸ кл/мл) при температуре 37±0,5°С в течение 30±5 мин с 0,8% сывороткой и с последующим измерением степени лизиса, после чего проводят расчет коэффициента эффекторной функции гетерофильных антител по системе комплемента (K_{ЭФГА-СК}) по формуле:

К_{ЭФГА-СК}=У/T_ГА,

где У - степень лизиса, %, Т_ГА - обратный титр гетерофильных антител к эритроцитам барана, по величине коэффициента относят к группе исследуемых с высоким более 13, или повышенным от 6 до 13, или нормальным от 5 до 6, или пониженным от 1,8 до 4,5, или низким ниже 1,8 коэффициентом, а определение нарушений иммунного статуса проводят путем сопоставления коэффициента эффекторной функции гетерофильных антител с относительным уровнем содержания циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке.

Разработанный способ включает забор крови, приготовление сыворотки, определение комплементактивирующей способности гетерофильных антител (ГА) в сыворотке по лизису эритроцитов барана, определение содержания иммуноглобулинов (IgG, IgA, IgM), определение титра ГА (проба Пауля-Буннелля), расчет коэффициента эффекторной функции гетерофильных антител по системе комплемента, определение относительного уровня содержания циркулирующих иммунных комплексов и сопоставление ее с К_{ЭФГА-СК} выявляет нарушения иммунного статуса человека.

Таким образом, технический результат, получаемый при реализации изобретения, заключается в углубленном исследовании не только клинически выраженных форм иммунологической недостаточности, но и доклинических форм иммунодефицита, аутоиммунных заболеваний, что открывает возможность для профилактики на самых ранних стадиях развития заболеваний, обусловленных сдвигами в эффекторной функции гетерофильных антител, в частности, и иммуноглобулинов, в целом, приводящих в конечном итоге к нарушениям солюбилизации и элиминации циркулирующих иммунных комплексов.

Пример. Способ определения нарушения иммунного статуса человека включает забор крови, приготовление сыворотки и поэтапное определение титра гетерофильных антител к эритроцитам барана, коэффициента эффекторной функции гетерофильных антител по активации системы комплемента и сопоставление коэффициента эффекторной функции гетерофильных антител по системе комплемента с относительным уровнем содержания циркулирующих иммунных комплексов.

Этап 1. Определение титра гетерофильных антител к эритроцитам барана.

Реакцию гемагглютинации (РГА) ставили в стандартных пластиковых 96-луночных микроплашках с круглодонными лунками.

Эксперименты были проведены следующим образом. Во все лунки вносили по 40 мкл 0,15 М раствора NaCl и готовили серии двукратных разведений сывороток. Затем во все лунки вносили по 40 мкл стандартизированной суспензии эритроцитов барана (1,5×10⁸ кл/мл) и перемешивали содержимое лунок путем осторожного встряхивания панели в горизонтальной плоскости. Панель, прикрытую сверху стеклянной пластинкой, выдерживают 30 мин при 37°С. Результаты реакции учитывали невооруженным глазом, определяли последнее разведение сыворотки, в котором еще произошла гемагглютинация. Контроль эритроцитов не содержал сыворотки. Проведенная проба Пауля-Буннелля выявила наличие во всех исследованных сыворотках гетерофильных антител. Результаты пробы Пауля-Буннелля представлены в табл.1.

Средний титр ГА к эритроцитам барана составил 1:21,50±17,86, т.е. колебания составили от 1:2 до 1:64. По содержанию ГА исследованные сыворотки были разбиты на группы:

1 группа (низкое содержание ГА от 1:2 до 1:8) включает сыворотки 1, 3, 4, 7, 10, 15;

Таблица 1
Титры гетерофильных антител к эритроцитам барана в сыворотке крови№ сывороткиТитр ГА(1:..)12216324256461678816932108111612641316143215816321732181619162032

2 группа (среднее содержание - титр 1:16) - сыворотки 2, 6, 8, 11, 13, 18, 19;

3 группа (повышенное - титр 1:32) - сыворотки 9, 14, 16, 17, 20;

4 группа (высокое содержание - титр 1:64) включает сыворотки 5 и 12.

Таким образом, определение титра ГА к эритроцитам барана (проба Пауля-Буннелля) является довольно информативным тестом, так как у одной женщины из 4 группы был ранее выставлен диагноз “ревматоидный полиартрит” (сыворотка №5) и наблюдались клинические признаки данного заболевания.

Этап 2. Определение коэффициента эффекторной функции гетерофильных антител по активации системы комплемента (К_{ЭФГА-СК}).

200 мкл суспензии эритроцитов (Б) (1,5×10⁸ кл/мл) инкубировали с разбавленной сывороткой крови человека в общем объеме 500 мкл, доведенном буфером VBS²⁺ (концентрация сыворотки 0,8%). Одновременно ставили контроль на спонтанный (200 мкл Е+300 мкл VBS²⁺) и полный лизис Е (200 мкл Е+300 мкл Н₂О). Пробирки встряхивали и инкубировали 30 мин при 37°С. После инкубации в каждую пробу добавляли по 2,5 мл холодного раствора 0,15 М NaCl, центрифугировали и определяли степень гемолиза по величине A₄₁₂ супернатанта.

Для учета степени лизиса (У) использовали формулу:

У(%)=[(X-R)/(H-R)×100],

где Н, R и Х - величины оптической плотности при A₄₁₂ гемолитичесхой системы при полном лизисе, в контроле спонтанного лизиса Е и в опытной пробе соответственно. Данные гемолиза эритроцитов барана с участием ГА и эндогенного комплемента приведены в табл.2.

Для определения величины (К_{ЭФГА-СК}) использовали формулу:

К_{ЭФГА-СК}=У/Т_ГА,

где У - степень лизиса, %, Т_ГА - обратный титр гетерофильных ангитет к эритроцитам барана.

Данные степени гемолиза эритроцитов барана, обусловленного гетерофильными антителами и эндогенным комплементом, титр гетерофильных антител и К_{ЭФГА-СК} приведены в табл.2.

Таблица 2
Определение К_{ЭФГА-СК} по данным степени лизиса и титра ГА№ сыв.СистемаСтепень лизиса (У, %)Титр ГА (1:..)К_{ЭФГА-СК}1Е+сыворотка25212,52Е+сыворотка90165,633Е+сыворотка822414Е+сыворотка542275Е+сыворотка35640,556Е+сыворотка83165,197Е+сыворотка81810,138Е+сыворотка87165,449Е+сыворотка81322,5310Е+сыворотка84810,5011Е+сыворотка80165,0012Е+сыворотка89641,3913Е+сыворотка83165,1914Е+сыворотка95322,9715Е+сыворотка7589,3816Е+сыворотка99323,0917Е+сыворотка63321,9718Е+сыворотка53163,3119Е+сыворотка83165,1920Е+сыворотка75322,34

Исследованные сыворотки по К_{ЭФГА-СК} распределились на 5 групп. Распределение по группам показано в табл.3.

Таблица 3
Распределение образцов сывороток по группам в зависимости от К_{ЭФГА-СК}Группа 1 (высокий)Группа 2 (повышенный)Группа 3 (средний)Группа 4 (пониженный)Группа 5 (низкий)№ сыв.К_{ЭФГА-СК}№ сыв.К_{ЭФГА-СК}№ сыв.К_{ЭФГА-СК}№ сыв.К_{ЭФГА-СК}№ сыв.К_{ЭФГА-СК}341112,5025,6392,5350,55427710,1365,19121,39    1010,5085,44142,97    159,38115,00163,09      135,19171,97      195,19183,31        202,34   34,0±9,9 10,63±1,33 5,27±0,22 2,51±0,68 0,55

Из данных табл.2 (степень лизиса, %) видно, что использование гетерофильных антител к эритроцитам барана в гемолитическом тесте, когда формируется иммунный комплекс (EA₄) и активируется собственная система комплемента по классическому пути, позволяет сформировать иммунный комплекс приближенно к физиологическим условиям. Из табл.2 видно, что концентрация сыворотки 0,8% является оптимальной для анализа, так как уровень лизиса колеблется в пределах 75-95% от полного лизиса. В сыворотках 1, 4, 5 и 17 уровень лизиса составляет 25, 54, 35 и 63% соответственно. Такие результаты могли быть обусловлены либо низким содержанием ГА, либо низкой эффекторной функцией этих антител по способности активировать классический путь эндогенного комплемента. Действительно, в сыворотках №1 и 4 титр ГА был самым низким (1:2), а в сыворотке №5 самым высоким (1:64).

Таким образом, отношение степени лизиса (У,%) эритроцитов барана в 0,8% сыворотке крови человека к обратному титру гетерофильных антител в этой же сыворотке (Т_ГА) позволило авторам получить коэффициент (К_{ЭФГА-СК}) и по величине этого показателя исследованные сыворотки разделить на пять групп: высокий (более 13), повышенный (от 6 до 13), средний (от 5 до 6), пониженный (от 1,8 до 4,5) и низкий (ниже 1,8).

Учитывая то, что эффекторная функция антител, комплемент-активирующая активность, тесно связана с процессом солюбилизации и элиминации циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), в крови необходимо было сравнить эти показатели.

Этап 3. Сопоставление К_{ЭФГА-СК} в группах с относительным уровнем содержания циркулирующих иммунных комплексов.

Определение циркулирующих иммунных комплексов проводили с использованием набора реагентов “Микроанализ ЦИК” производства А/О “НПО СИНТЕКО” г. Москва. Принцип метода: находящиеся в сыворотке иммунные комплексы определяются при помощи преципитации полиэтиленгликолем 6000 (ПЭГ 6000) определенной концентрации путем сравнения величины светопропускания опытного (сыворотка в среде с ПЭГ) и контрольного (сыворотка в среде без ПЭГ). Нормальное содержание ЦИК в сыворотке крови человека этим методом составляет до 55 у.е.

Данные показателей К_{ЭФГА-СК} и ЦИК представлены на табл.4.

Таблица 4
Показатели К_{ЭФГА-СК}и ЦИК сыворотки крови
Группа 1 (высокий уровень К_{ЭФГА-СК})№ сыворотки34M±mК_{ЭФГА-СК}412734,0±9,9ЦИК, у.е.657067,50±3,54

Группа 2 (повышенный уровень К_{ЭФГА-СК})№ сыворотки171015M±mК_{ЭФГА-СК}12,5010,1310,509,3810,63±1,33ЦИК, у.е.82551108783,50±22,58Группа 3 (средний уровень К_{ЭФГА-СК})№ сыворотки268111319M±mК_{ЭФГА-СК}5.635.195.445.005.195.195,27±0,22ЦИК. у.е.524032745711561,67±29,87Группа 4 (пониженный уровень К_{ЭФГА-СК})№ сыворотки9121416171820М±mК_{ЭФГА-СК}2,531,392,973,091,973,312,342,51±0,68ЦИК. у.е.7516087120801124096,29±38,39Группа 5 (низкий уровень К_{ЭФГА-СК})№ сыворотки5К_{ЭФГА-СК}0.55ЦИК. у.е.21

Из представленных в табл. 4 данных видно, что наиболее предпочтительным показателем К_{ЭФГА-СК} является 5,27±0,22, так как в этой группе относительный уровень содержания ЦИК составляет 61,67-29,87 у.е. И если исключить сыворотку №19, то среднее содержание ЦИК составит 51,00±16,18 у.е. Такие показатели, как имеющиеся в сыворотке №9, могут предполагать состояние, когда при нормальной активации комплемента иммунными комплексами страдает элиминирование ИК с участием рецептора к С3b-CR1 рецептора эритроцитов человека.

Следовательно, К_{ЭФГА-СК}, рассчитанный по группе №3, можно принять за коэффициент в норме. Увеличение или уменьшение этого коэффициента сопровождается существенными сдвигами в относительном уровне содержания ЦИК. Эти сдвиги имеют определенную динамику, то есть при повышенных значениях этого коэффициента (10,63±1,33) наблюдается также увеличение относительного уровня содержания ЦИК (83,50±22,58 у.е.), а при более высоких значениях коэффициента (34,0±9,9) уровень ЦИК заметно снижается (67,50±3,54 у.е.).

Аналогичные эффекты наблюдаются при пониженных величинах К_{ЭФГА-СК} (2,51±0,68). Уровень содержания ЦИК составляет в этой группе 96,29±38,39 у.е., а при более низких значениях К_{ЭФГА-СК} (0,55) относительный уровень содержания ЦИК составляет всего 21 у.е.

Определение концентрации IgG, IgA и IgM в этих сыворотках проводили методом радиальной иммунодиффузии в геле (РИД). Данные содержания иммуноглобулинов представлены в табл.5.

Из представленных в табл.5 данных видно, что только в сыворотке №16 содержание IgM незначительно превышает нормальный показатель (на 0,02 мг/мл). Следовательно, определение содержания иммуноглобулинов методом РИД не выявило существенных отклонений от показателей в норме.

Таким образом, разработанный способ позволяет вести углубленное исследование не только клинически выраженных форм иммунологической недостаточности, но и доклинических форм иммунодефицита, аутоиммунных заболеваний, что открывает возможность для профилактики на самых ранних стадиях развития заболеваний, обусловленных нарушением иммунного статуса человека, обусловленных сдвигами в эффекторной функции гетерофильных антител (комплемент-активирующей способности иммуноглобулинов), которые приводят к нарушению утилизации иммунных комплексов.

Таблица 5
Содержание иммуноглобулинов (IgG, IgA, IgM) в сыворотке крови№ сывороткиIgG, мг/мл (N=7,6-18,8)IgA, мг/мл (N=0,85-5,7)IgM, мг/мл (N=0,46-2,2)19,22,420,89211,964,61,3239,342,61,55411,963,581,17511,962,610,7468,801,271,22711,604,790,81813,454,790,85910,593,140,60168,31,432,22179,42,130,67189,72,851,071910,31,431,21M±m10,50±1,552,90±1,241,10±0,44

ЛИТЕРАТУРА

1. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология: Пер. с англ. М.: Мир, 2000. - 592 с.

2. Bogers W.M.J.M., Stad R-K., van Es L., Daha M.R. Immunoglobulin A: Interaction with Complement, Phagocytic Cells and Endothelial Cells // Complement Inflamm. 1991. V.8. P.347-358.

3. Roos A., Bouwman L.H., van GijIswijk-Janssen D.J., et al. Human IgA Activates the Complement System Via the Mannan-Binding Lectin Pathway // J.Immunol. 2001. V.167. P.2861-2868.

4. Sahu A., Lambris J.D. Complement inhibitors: a resurgent concept in anti-inflammatory therapeutics // Immunopharmacology. 2000. V.49. P.133-148.

5. Клиническая иммунология и аллергология. Под ред. Г.Лолора-младшего, Т.Фишера и Д.Адельмана. Пер. с англ. М.: Практика, 2000. - 806 с.

6. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник /Меньшиков В.В., Делеторская Л.Н., Золотницкая Р.П. и др.: Под ред. В.В. Меньшикова. М.: Медицина, 1987. - 368 с.

7. Muller-Eberhard H.J., Hoffmann L.G., Mayer M.M. Complement. In: Methods in Immunology and Immunochemistry / Eds. Williams C., Chase M.W. New York: Acad. Press. 1974. V.4. P.127-274.

Изобретение относится к области медицинской иммунологии и может быть использовано для определения нарушения иммунного статуса человека. Сущность изобретения заключается в определении в сыворотке крови человека титра гетерофильных антител по методу Пауля-Буннелля, относительного уровня циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), комплементактивирующих свойств гетерофильных антител путем инкубации стандартизированных эритроцитов барана в течение 30±5 мин с 0,8% сывороткой и с последующим измерением степени лизиса эритроцитов. Затем проводят расчет коэффициента эффекторной функции гетерофильных антител по системе комплемента (К_{ЭФГА-СК}) по формуле: К_{ЭФГА-СК}=У/Т_ГА, где У – степень лизиса, %, Т_ГА – обратный титр гетерофильных антител к эритроцитам барана, а определение нарушения иммунного статуса проводят путем сопоставления коэффициента с относительным уровнем содержания ЦИК в сыворотке. Технический результат - выявление и доклинических форм иммунодефицита, и аутоиммунных заболеваний, что открывает возможность для профилактики их на самых ранних стадиях развития. 5 табл.

Способ определения нарушения иммунного статуса человека, включающий исследование в сыворотке крови антител и циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), отличающийся тем, что определяют титр гетерофильных антител по методу Пауля-Буннелля, затем относительный уровень ЦИК методом преципитации ПЭГ 6000 и комплементактивирующие свойства гетерофильных антител, путем инкубации стандартизированных эритроцитов барана (1,5·10⁸ кл/мл) при температуре 37±0,5°С в течение 30±5 мин с 0,8% сывороткой и с последующим измерением степени лизиса эритроцитов, после чего проводят расчет коэффициента эффекторной функции гетерофильных антител по системе комплемента (К_{ЭФГА-СК}) по формуле:

К_{ЭФГА-СК}=У/Т_ГА,

где У - степень лизиса, %, Т_ГА - обратный титр гетерофильных антител к эритроцитам барана, а определение нарушений иммунного статуса проводят путем сопоставления коэффициента эффекторной функции гетерофильных антител с относительным уровнем содержания (ЦИК) в сыворотке.