СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВОКОКЛЮШНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА Российский патент 1998 года по МПК A61K39/10 

Изобретение относится к медицинской биотехнологии и может быть использовано при получении антитоксического противококлюшного иммуноглобулина.

Известен способ получения провококлюшного иммуноглобулина путем иммунизации доноров убитой культурой коклюшного микроба с последующими выделением IgG фракционированным осаждением этанолом по Кону (Balagtas R.C., Kenrad E. N. , Levin S. , Gottoff S.P. Treatment of pertussis wirh pertussis immune globulin. J. Pediatrics, 1971, 79, 2, 203-208).

Известен также способ получения противококлюшного иммуноглобулина путем отбора индивидуальных донорских сывороток крови по результатам реакции агглютинации с коклюшным микробом с последующим выделением IgG фракционированным осаждением этанолом (Morris D. , McDonald J. Falure of hiperimmune gamma globulin prevent whooping cough. Archs. Dis. Child., 1957, 32, 236).

Однако целевые продукты, получаемые данными способами, обладают низкой терапевтической эффективностью, особенно при лечении тяжелой формы коклюша, что подтверждается снятием соответствующих препаратов с производства. Так, по данным (Pittman M., Gardner R., Marshall J. Evaluation of the potency of antipertussis serum products. J. Biol. Stand., 1979, 7, 263-273), в 30-50-е годы противококлюшный иммуноглобулин выпускался 17 фирмами, а в 1965 г. их число сократилось до 2. Далее IgG были заменены на средства симптоматической терапии.

Целью предлагаемого способа является повышение терапевтической эффективности целевого продукта.

Указанная цель достигается тем, что в способе получения противококлюшного иммуноглобулина, предусматривающем отбор индивидуальных донорских сывороток крови, содержащих противококлюшные антитела (АТ), с последующим выделением иммуноглобулина осаждением этанолом, в индивидуальных сыворотках определяют активность антител к коклюшному экзотоксину, и для выделения целевого продукта отбирают сыворотку с антитоксической активностью не менее 80 ед/мл.

Предлагаемый способ основан на впервые реализованной в нем концепции направленной нейтрализации действия коклюшного экзотоксина. Именно поэтому отбор донорской сыворотки производят не просто по наличию противококлюшных АТ как в прототипе, а по активности антитоксических АТ.

При технической реализации способа в качестве сырья возможно использование плазмы крови, что повышает его технологичность (забирают больше донорского сырья и отпадает необходимость его освобождения от эритроцитов). Целесообразна паспортизация доноров с высоким содержанием антитоксических АТ в крови.

Контроль исходного сырья на содержание антитоксических противококлюшных АТ целесообразно проводить в твердофазном иммуноферментном анализе (ИФА) с использованием в качестве лиганда церулоплазмина, например, по авт.св. СССР N 1698783, 1991. В этом случае лиганд обеспечивает избирательную адсорбцию коклюшного анатоксина, создавая стерические препятствия для взаимодействия АТ с неиммунодоминантными сайтами молекулы токсина, что обеспечивает высокую специфичность реакции.

Пример 1. Индивидуальные сыворотки доноров, в том числе из плацентарной крови, контролируют на содержание антитоксических противококлюшных АТ в твердофазном ИФА с использованием в качестве лиганд церулоплазмина человека, а в качестве антигена - очищенного коклюшного экзотоксина. Кроме того, сырье контролируют на содержание противококлюшных АТ в реакции агглютинации (РА) культуры B. pertussis сероваров 1, 2, 3 (штамм 475 ГИСК). О результатах контроля судят в сравнении с реакцией стандартного образца противококлюшных АТ (ОСО 42-28-182-90).

Сыворотки с близкими значениями содержания АТ объединяют и контролируют вторично.

Каждую группу сывороток подвергают 4-стадийному осаждению этанолом при объемной концентрации последнего 8 , 17, 17 и 24% соответственно. Осаждение проводят при температуре -10^oC в течение 2 суток на каждой стадии. По окончании каждой стадии осадок отделяют центрифугированием на проточной центрифуге при факторе разделения F=10000 и растворяют в 8 объемах физиологического раствора. По окончании осаждения концентрацию белка в растворе доводят физраствором до 10 мас.% и производят осветляющее фильтрование через асбестовую пластину. Далее удаляют остаточный этанол через асбестовую пластину. Далее удаляют остаточный этанол ультрафильтрацией через полые волокна, после чего целевой продукт стерилизуют фильтрованием через мембраны "Millipor" с диаметром пор 0,22 мкм.

В полученном препарате определяют содержание антитоксических АТ как описано выше. Результаты приведены в табл. 1.

Как видно из табл. 1 использование сырья с антитоксическим титром менее 80 ед/мл неэкономично из-за низкого выхода целевого продукта. Кроме того, низкий титр антитоксических АТ в конечном продукте партий NN 1 и 2 недостаточен в отношении терапевтического действия препарата (доказывается ниже).

Партия препарата NN 2-4 используют в Инфекционной клинической больнице N 1 г. Москвы и в Московской области клиническом институте им. А.Ф.Владимирова для лечения детей в возрасте до 3-х лет, больных коклюшной инфекцией при средней и тяжелой степенях тяжести. Партию N 5 не испытывают, поскольку она не представляет технологического интереса из-за крайней редкой встречаемости доноров с титром антитоксических АТ более 120 ед/мл (менее 5%).

Контрольную группу больных детей лечат общеизвестным способом, а именно антибиотикотерапией.

Детям опытных и контрольной групп дополнительно назначают симптоматическое лечение.

Испытуемый препарат назначают в дозе 1,5 мл 2-3 раза с интервалом 3 дня. Лечение начинают в день поступления в клинику или на следующий день, преимущественно в ранние сроки болезни (1-2 неделя).

Эффект лечения оценивают как положительный, если к его концу имеет место значительное уменьшение числа и тяжести коклюшных приступов, исчезновение цианоза лица во время приступов кашля, уменьшение лейкоцитоза, а также улучшение общего состояния и самочувствия больного.

В тех случаях, когда течение коклюша под влиянием примененного лечения в течение 7-9 дней меняется, регистрируют отсутствие эффекта. По окончании медикаментозного лечения наблюдение за детьми продолжают для установления срока выздоровления.

Результаты лечения приведены в табл. 2.

Как видно из табл. 2, препараты с содержанием антитоксических АТ в сырье 80 и 120 ед/мл (партии NN 3 и 4) обеспечивают наступление терапевтического эффекта в 87,0-90,5% случаев при среднем сроке выздоровления 21-23 дня, тогда как в контрольной группе на ранние сроки выздоровел лишь 1 пациент, а средняя длительность выздоровления составляет 32 дня.

Пример 2. Индивидуальные плазмы крови доноров, полученные с помощью плазмофореза, контролируют как в примере 1, делят на две партии по пороговому значению индивидуальной активности 80 ед/мл и определяют активности сведенных образцов. Они составляют 60 и 110 ед/мл соответственно. Агглютинирующая активность обеих партий характеризуется обратным титром 80.

Плазму осветляют центрифугированием на проточной центрифуге при F=15000, далее выделяют и стерилизуют IgG как в примере 1.

Содержание антитоксических АТ составляет в первой партии 250 ед/мл, а во второй - 540 ед/мл.

Препараты испытывают в Инфекционной больнице N 1 г. Уфы по схеме, указанной в примере 1. Результаты приведены в табл. 3.

Как видно из табл. 3 препарат с содержанием антитоксических АТ в сырье 110 ед/мл (партия N 2) обеспечивают наступление терапевтического эффекта в 85,7% случаев при среднем сроке выздоровления 20 дней, тогда как в контрольной группе на ранние сроки выздоровело лишь 8% при средней длительности выздоровления 35 дней. Данный пример, как в пример 1, иллюстрирует также то обстоятельство, что агглютинирующая активность специфических АТ не коррелирует с содержанием антитоксических АТ, и поэтому не может являться показателем отбора сырья.

Использование предлагаемого способа позволяет получить новый вид иммуноглобулинов, а именно противококлюшный антитоксический иммуноглобулин, эффективность применения которого по сравнению с общеизвестной антибиотикотерапией выше как в отношении времени наступления терапевтического эффекта, так и длительности лечения, что проиллюстрировано данными приведенных примеров (терапевтический эффект на 7-9 день наблюдается у 87,0-90,5% больных; средний срок полного выздоровления 20-23 дня).

Изобретение относится к медицинской биотехнологии и может быть использовано при получении антитоксического противококлюшного иммуноглобулина. Цель изобретения - повышение терапевтической эффективности целевого продукта. Способ осуществляют путем фракционированного осаждения специфического сывороточного иммуноглобулина этанолом. Новым в способе является отбор исходного сырья (донорской сыворотки, плазмы крови) из расчета содержания антитоксическим противококлюшных антител не менее 60 ед/мл. При использовании целевого продукта для лечения коклюша у детей младшего детского возраста терапевтический эффект наблюдается на 7-9 день у 87-90%. 3 табл.

Способ получения противококлюшного иммуноглобулина, предусматривающий отбор индивидуальных донорских сывороток крови, содержащих специфические антитела, с последующим выделением JgG фракционированным осаждением этанолом, отличающийся тем, что, с целью повышения терапевтической эффективности целевого продукта, в индивидуальных сыворотках определяют активность антител к коклюшному экзотоксину и отбирают для выделения целевого продукта сыворотки с антитоксической активностью не менее 80 ед/мл.