СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФИМБРИАЛЬНОГО АДГЕЗИНА Российский патент 1997 года по МПК A61K39/02 A61K39/108 

Изобретение относится к медицинской биотехнологии и касается получения бактериального фимбриального адгезина (ФА), используемого в диагностических и профилактических целях.

Известен способ получения бактериального фимбриального адгезина, предусматривающий культивирование микроорганизма-продуцента с последующим отделением, лиофильным высушиванием и γ-облучением микробных клеток (заявка 92015067/13, от 21.01.93).

Известен также способ получения бактериального фимбриального адгезина путем культивирования отдельных штаммов иерархической группы микроорганизмов с последующим отделением фимбрий от клеточного материала, не имеющего фимбрий, и остаток клеток. Полученные таким образом фимбрии используют для получения антисывороток (патент США 4769240, кл.А61К 39/02, 1088).

Наиболее близок к заявляемому способ получения фимбриального адгезина, включающий культивирование микроорганизма-продуцента с последующим инактивированием, отделением и механическим дезинтегрированием микробных клеток и выделением фимбрий сульфат-аммонийным осаждением (а.с. СССР 1777607, кл. С12N 1/20, 1990).

Однако препараты, получаемые известными способами, обладают низкой специфичностью, вплоть до того, что, как отмечено в описании вышеуказанного патента США, дополнительно проводят нормализацию степени перекрестных реакций путем истощения перекрестными антителами. Этот недостаток имеет место в связи с тем, что действующее начало (фимбриальный адгезин) находится в нерастворимом состоянии, будучи связанным с поверхностными структурами.

Целью предлагаемого способа является повышение специфичности целевого продукта.

Указанная цель достигается тем, что в способ получения фимбриального адгезина, включающий культивирование микроорганизма-продуцента с последующим инактивированием, отделением и механическим дезинтегрированием микробных клеток и выделением фимбрий сульфат-аммонийным осаждением, вносят следующие изменения:
а) микробные клетки перед механическим дезинтегрированием отмывают от капсульных соединений насыщенным раствором NaCl;
б) выделенные фимбрии диализуют против фосфатного буферного раствора (для освобождения от неорганических примесей);
в) диализ подвергают химическому дезинтегрированию под действием ультразвука для более полного перевода материала в растворимое состояние;
г) дезинтегрированный диализат подвергают гель-фильтрации для извлечения активной фракции адгезина;
д) активную фракцию концентрируют обработкой полиэтиленгликолем (ПЭГ) для получения готовой формы целевого продукта.

Способ поясняется следующими примерами.

Пример 1. Микробные культуры Klebsiella pneumoniae шт. 448 и Escherichia coli шт. СFA-1 выращивают раздельно в мясо-пептонном бульоне при 37^oC в течение 1 суток. Концентрация клеток в выращенных культурах составляет 15 и 18 млрд/мл для К. pneumoniae и E. coli соответственно. Культуры инактивируют 0,25 об. формалина в течение 30 мин и отделяют от культуральной жидкости центрифугированием в течение 30 мин при 6000 об/мин и температуре 4^oC. Центрифугаты каждой из культур делят на две порции, трехкратно промывают пятью объемами физиологического и насыщенного растворов хлорида натрия и контролируют на наличие капсульных полисахаридов в реакции агглютинации (РА) с соответствующими референс-сыворотками (к К-антигенам). Результаты контроля приведены в табл. 1.

Как видно из таблицы, культуры, отмытые ненасыщенным раствором хлорида натрия, дают положительную РА с соответствующими антисыворотками, что свидетельствует о низкой степени освобождения от остатков капсульных компонентов микроорганизмов.

Отмытые центрифугаты подвергают диализу против 0,01 М фосфатного буферного раствора рН 7,2, а затем обработке на механическом дезинтеграторе "Virtus" при 20000 Rpm в течение 5 мин. Фимбрии отделяют от клеток центрифугированием при факторе разделения F-10000 в течение 30 мин при 4^oC c последующим осаждением сульфатом аммония из расчета 75% насыщения в течение 18 ч при той же температуре. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием при 12000 об/мин в течение 30 мин при 4^oC, ресуспендируют в 10 об. и 0,01 М фосфатного буферного раствора рН 7,2 и подвергают диализу против 0,005 М фосфатного буферного раствора в течение 1 суток при 4^oC, а затем против 0,01 М фосфатного буферного раствора при тех же температуре и экспозиции.

Далее производят химическое дезинтегирование полуфабриката обработкой 1 мас. дезоксихолата натрия. Операцию проводят на ультразвуковом дезинтеграторе при частоте 7 кГц в течение 5 мин (два цикла по 2,5 мин с интервалом 5 мин) при температуре 2^oC. Полученный фимбриальный адгезин, переведенный в растворимое состояние, освобождают от дефектных интерферирующих частиц центрифугированием по холоду при 24000 об/мин в течение 45 мин. Супернатант подвергают гель-фильтрации на колонке с гелем на декстрановой основе Sephacril S-200 (диаметр частиц 40 105 мкм) и элюируют 0,05 М фосфатным буферным раствором под контролем нефелометра. Фракцию с максимальным значением экстинкции отбирают и концентрируют обработкой 50 мас. ПЭГ. Выход целевого продукта в партиях, полученных при отмывке микробных клеток насыщенным раствором хлорида натрия, составляет 1/3 и 1/4 объема элюатов К. pneumoneaе и E. coli соответственно. В остальных партиях этот выход ниже (табл. 1). Степень концентрирования полученных препаратов 1,8 2,3 раза.

При контроле полученных препаратов в реакции двойной диффузии в геле с антифимбриальными референс-сыворотками титры составляют от 1:2 до 1:16.

Пример 2. ФА получают из культур К. pneumoneae шт. 557 и Е. сoli шт. CFA-П как в примере 1. При этом операцию отмывки микробных клеток хлоридом натрия осуществляют при насыщенной концентрации последнего, а при проведении операции гель-фильтрации для различных партий полуфабриката используют матрицы с различными основами. Выход препаратов при использовании различных матриц на стадии гель-фильтрации (в процентах от объема химического дезинтегратора) указан в табл. 2.

При контроле полученных препаратов в реакции двойной диффузии в геле с антифимбриальными референс-сыворотками титры составляют 1:4 и 1:8 для декстрановых основ. Для препаратов, полученных на сефарозе и биогеле, положительную реакцию наблюдают в цельном элюате и при титре 1:2.

Пример 3. ФА получают из культур K. pneumoneae шт. 448 и 557 как в примере 1. При этом отмывку микробных клеток осуществляют при насыщенной концентрации NaCl, а гель-фильтрацию дезинтеграта проводят на Sephacril S-200. Полученными адгезинами иммунизируют кроликов. Гипериммунные сыворотки отбирают и исследуют в реакции двойной диффузии в геле (РДДГ) с препаратами ФА (табл. 3). В качестве контроля в РДДА исследуют также кроличьи гипериммунные антисыворотки из ФА, полученных по а.с. 1777607.

Как видно из табл. 3, антисыворотки к ФА, полученному предлагаемым способом, обладают более высокой специфичностью по сравнению с антисыворотками, полученными прототипным способом. Этот эффект является производным от высокой степени очищенности целевого продукта в предлагаемом способе и подтверждает достижение вышеуказанной цели изобретения.

Использование: медицинская биотехнология, бактериальный фимбриальный адгезин, диагностический и профилактический препараты. Сущность изобретения: способ предусматривает культивирование микроорганизма-продуцента с последующим инактивированием, отделением и механическим дезинтегрированием микробных клеток и выделением фимбрий сульфат-аммонийным осаждением. Для повышения специфичности целевого продукта микробные клетки перед дезинтегрированием отмывают насыщенным раствором хлорида натрия, а выделенные фимбрии подвергают диализу против фосфатного буферного раствора, а затем ультразвуковому и химическому дезинтегрированию, гель-фильтрации и концентрированию обработкой полиэтиленгликолем. 3 табл.

1 Способ получения фимбриального адгезина путем культивирования микроорганизма-продуцента с последующим инактивированием, отделением и механическим дезинтегрированием микробных клеток и выделением фимбрий из дезинтеграта, отличающийся тем, что перед дезинтегрированием микробные клетки отмывают насыщенным раствором хлорида натрия, выделение фимбрий проводят сульфат-аммонийным осаждением, а выделенные фимбрии подвергают диализу против фосфатного буферного раствора и затем ультразвуковому и химическому дезинтегрированию, гель-фильтрации и концентрированию полиэтиленгликолем.