Изобретение относится к генетической инженерии и, в частности, к трансформации растений, при которой растение трансформируют чужеродной ДНК для экспрессии гетерологичного гена.
Хотя в последние годы достигнут значительный прогресс в получении трансгенных растений, экспрессирующих чужеродные белки, такие как ферменты устойчивости к гербицидам и белки оболочки вирусов, очень мало известно об основных факторах, воздействующих на эту экспрессию. Выявлено несколько потенциальных факторов, оказывающих влияние на уровень экспрессии белка, кодируемого чужеродным геном. При этом количество мРНК в клетке, несомненно, критический фактор.
Известно много потенциальных причин, которые обуславливают низкий уровень мРНК. Во-первых, синтез полноразмерной РНК может не идти с высокой частотой. Это могло быть обусловлено, например, преждевременной терминацией РНК или ее неожиданным процессингом во время транскрипции. Во-вторых, полноразмерная РНК может продуцироваться, но затем она процессируется [сплайсинг, присоединение поли(A)] в ядре так, что образуется нефункционирующая мРНК. Если РНК правильно синтезирована, терминирована и полиаденилирована, то тогда она транслируется в цитоплазме. В цитоплазме мРНК имеют определенное время жизни, которое детерминируется их последовательностями и клеточным типом, в котором они экспрессируются. Некоторые РНК очень короткоживущие, а некоторые гораздо более долгоживущие. В дополнение, имеется эффект, важность которого неопределена, это - трансляционная эффективность. Кроме того, каждая молекула РНК складывается в определенную структуру или, возможно, семейство структур, которые детерминируются ее последовательностью. Следовательно, последовательность любой РНК может обеспечивать большую или меньшую ее стабильность в цитоплазме. Структура мРНК также определяется процессингом в ядре. К сожалению, невозможно предсказать и почти невозможно определить структуру любой РНК (за исключением тРНК) in vitro или in vivo. Однако похоже, что изменение последовательности РНК сказывается на принимаемой ею структуре. При этом структура или отдельные структурные черты мРНК определяют ее стабильность.
В РНК идентифицировано несколько отдельных последовательностей или сигналов, которые могут оказывать специфический эффект на ее стабильность. Эти идентифицированные последовательности часто A+T богатые, и таким образом, более вероятно, что встречаются в A+T кодирующей последовательности, такой как B.t ген. Последовательность АТТТА (или АУУУА в РНК) является дестабилизирующей последовательностью в мРНК клеток млекопитающих (Shaw G. and Kamen R. , Cell, 1989, 46:659-667). Работ, относящихся к функционированию такой последовательности в растениях, не проводилось. Многие короткоживущие мРНК имеют A+T богатые 3' нетранслируемые районы, и эти районы часто имеют ATTTA последовательность, иногда присутствующую во многих копиях или как мультимеры (то есть, АТТТАТТТА...). Показано, что перенос 3'конца нестабильной мРНК к стабильной РНК (глобина или VA1) значительно уменьшает время полужизни этой РНК (Shaw G. and Kamen R., 1986). В дальнейшем было показано, что пентамер АТТТА оказывает дестабилизирующий эффект на стабильный предшественник. Причем этот сигнал может оказывать свои эффекты в зависимости от его расположения на 3' конце или внутри кодирующей последовательности. Однако положение последовательностей АТТТА и/или последовательностей, по соседству с которыми они оказываются, так важно для определения, функционируют ли они как дестабилизирующие последовательности. Показано также, что тример АТТТА оказывал гораздо меньший эффект на стабильность мРНК, чем пентамер, а димер или мономер не влиял на ее стабильность (Shaw G. and Kamen R., 1987, RNA Processing, Cold Spring Harbor Laboratory, p.220). Заметьте, что мультимеры АТТТА, такие как пентамер, автоматически образуют A+T богатый район. Это, как было показано, оказывает цитоплазматический, а не ядерный эффект. У других нестабильных мРНК последовательность АТТТА может присутствовать только в одной копии, но часто содержится в A+T богатом районе. Из данных по клеткам животных, собранных к настоящему времени, оказывается, что АТТТА в некоторых окружениях благотворна для стабильности, но еще невозможно предсказать, в каких положениях АТТТА являются дестабилизирующими элементами.
Некоторые исследования по деградации мРНК в животных клетках также указывают, что деградация РНК в некоторых случаях может начаться с нуклеотической атаки на A+T богатые районы. Однако не ясно, происходит ли при этом разрезание в АТТТА последовательностях. Существуют также примеры мРНК, которые имеют различную стабильность, зависящую от типа клетки, в которых они экспрессируются, или от стадии клеточного цикла, на которой они экспрессируются. Например, гистоновые мРНК стабильны во время синтеза ДНК, но нестабильны, если синтез ДНК прекращен. Считается, что за этот эффект ответственен 3'конец некоторых гистоновых мРНК (Pandey N.B. and Marzluff W.F., 1987, RNA Processing, Cold Spring Harbor Laboratory, p.133). Однако все еще остается неясным, что контролирует разную стабильность этой мРНК. Другой пример дифференциальной стабильности мРНК - Igb в B-лимфоцитах во время созревания B клеток (Genovese C. and Milcarek C., 1988, RNA Processing, Cold Spring Harbor Laboratory, p.62). Последний пример - нестабильность мутантной бета-талласемийной глобиновой мРНК. В клетках костного мозга, где этот ген нормально экспрессируется, мутантная мРНК нестабильна, в то время как мРНК дикого типа стабильна. Когда мутантный ген экспрессируют в Hela или L клетках in vitro, мутантная мРНК не показывает нестабильности. Это подтверждает тот факт, что стабильность мРНК может определяться типом клетки или фактором, специфичным для клеточного цикла. Более того, этот тип нестабильности пока не ассоциирован со специфическими последовательностями. Учитывая это, зачастую невозможно предсказать, какие РНК нестабильны в данной клетке. Даже АТТТА последовательность может действовать различно в зависимости от природы клетки, в которой присутствует данная РНК (Shaw G. and Kamen R., 1987). Сообщается, например, что активация протеинкиназы C может блокировать деградацию, опосредованную АТТТА (Shaw G.and Kamen R., 1987).
Добавление участка полиаденилирования к 3' концу - общая черта большинства эукариотических мРНК как растений, так и животных. В результате добавления полиA транскрипт имеет большую протяженность 3' конца, чем зрелый белок. Внутри этого транскрипта находятся сигналы полиаденилирования и образования правильного 3' конца. Этот процессинг на 3' конце включает расщепление мРНК и добавление полиA к зрелому 3' концу. Поиск последовательностей, расположенных рядом с полиA сигналом, как в растительных, так и в животных мРНК возможно позволит идентифицировать последовательности, которые кодируют добавление полиA и расщепление 3' конца. Как правило, эти сигналы являются вариацией последовательности ААТААА. В клетках животных было идентифицировано несколько вариантов этой последовательности, которые являлись функциональными. В растительных клетках, по-видимому, существует большее количество функциональных последовательностей (Wickens M. and Stephenson P., Science, 1984, v. 226, p.1045; Dean C. et al., Nucleic Acids Research, 1986, v.14, N 5, p. 2229). Поскольку все эти последовательности вариации ААТААА, они все А+Т богатые. Эта последовательность обычно находится за 15-20 пн до полиA участка в зрелой мРНК. Эксперименты на животных клетках показывают, что эта последовательность участвует как в полиаденилировании, так и в 3' созревании. Сайт - направленными мутациями в этой последовательности можно нарушить эти функции (Conway L. and Wickens M., 1988, RNA Processing, Cold Spring Harbor Laboratory, p.40; Wickens M. et al., 1987, RNA Processing, Cold Spring Harbor Laboratory, p.9). Однако также наблюдали, что последовательности за 50-100 пн после 3' полиА сигнала также необходимы. Так, например, ген, который имеет нормальный ААТААА, но был перемещен или прерван ниже, не был правильно полиаденилирован (Gil A. and Proudfoot N.J., Nature, 1984, v.312, p.473; Sadofsky M. and Alwine J.C., Molecular and Cellular Biology, 1984, v. 4, N 8, pp.1460-1468; McDevitt M.A. et ai., Cell, 1984, v.37, pp.993-999).
То есть, сам по себе сигнал полиА не существенен для полного и правильного процессинга. Неизвестно, какие специфичные, лежащие по ходу транскрипции последовательности требуются в дополнение к сигналу полиА, или существует ли специфичная последовательность, которой присуща эта функция. Следовательно, анализ последовательности позволяет только обнаружить потенциальные полиА сигналы.
В природных, нормальных полиаденилированных мРНК наблюдали, что при нарушении этого процесса посредством изменения сигнала полиА либо других последовательностей в этой мРНК получают значительные эффекты на уровне функциональной мРНК. Это наблюдали в случае нескольких природных мРНК. Однако не существует общих правил, которые можно было бы вывести из изучения мутантов этих природных генов, и нет правил, которые можно было бы приложить к гетерологичным генам. Ниже приводятся четыре примера.
1. В глобиновом гене отсутствие правильного сайта полиА ведет к неправильной терминации транскрипции. По-видимому (хотя и не доказано), неправильно терминированная РНК нефункциональна и нестабильна (Proudfoot N.J. et al., 1987, RNA Processig, Cold Spring Harbor Laboratory, p.17).
2. В глобиновом гене отсутствие функционального сигнала полиА может приводить к 100-кратному уменьшению уровня накопления мРНК (Proudfoot N.J.et al., 1987).
3. Сайт полиА глобинового гена перемещали в 3' концы двух различных гистоновых генов. Гистоновые гены около их 3' конца имеют вторичную структуру (стебель-петля). Количество правильно полиаденилированной гистоновой мРНК, продуцируемой с этих химер, уменьшалось при увеличении дистанции между стеблем-петлей и сайтом полиА. Кроме того, два гистоновых гена продуцировали значительно различающиеся уровни правильно полиаденилированных мРНК. Это предполагает взаимодействие между сайтом полиА и другими последовательностями на мРНК, которые модулируют накопление мРНК (Pandey N.B. and Marzluff W.F., 1987).
4. Ген леггемоглобина сои клонировали в клетках Hela. Было показано, что этот растительный ген содержит "загадочный" сигнал полиаденилирования, который активен в животных клетках, но не утилизируется в растительных. Это обеспечивает продукцию новой полиаденилированной мРНК, которая нефункциональна. Следовательно, анализ гена в клетках одного типа не может предсказать его поведение в альтернативных клеточных типах (Wiebauer K. et al., Molecular and Cellular Biology, 1988, v.8, N 5, pp.2042-2051).
Из этих примеров ясно, что в природных мРНК правильное полиаденилирование важно для накопления мРНК и что нарушение этого процесса может воздействовать на уровень мРНК. Однако имеется еще недостаточно знаний, чтобы предсказать эффект изменений в нормальном гене. В гетерологичном гене, у которого мы не знаем, функциональны ли имеющиеся полиА сайты (последовательности консенсуса), еще труднее предсказать последствия. Существует такая возможность, что имеющиеся сайты, которые идентифицированы, нефункциональны. То есть, эти сайты могут не действовать как правильные сайты полиА, а вместо этого функционировать как аберрантные сайты, которые дают увеличение нестабильных мРНК.
В системах животных клеток общий сигнал ААТААА гораздо чаще обнаруживается в мРНК выше полиА сигнала (Wickens M. and Stephenson P., 1984).
В растениях не было осуществлено такого обширного анализа, но ясно то, что могут использоваться множественные последовательности, подобные ААТААА. Сайты полиаденилирования растений, названные минорными или мажорными, были изучены на трех типах растительных генов (Dean C. et al., 1986). Обозначение сайтов как мажорного или минорного относится к частоте встречаемости функционирующих сайтов в анализируемых природных генах. Трудно с определенностью предсказать, какой сайт мажорный или минорный с большей или меньшей вероятностью, частично или полностью функционирует, находясь в гетерологичном гене, таком как B.t (см. табл.1).
Другой тип процессинга РНК, который происходит в ядре, это сплайсинг интронов. Почти вся работа по сплайсингу интронов сделана на животных клетках, но некоторые данные появились при исследовании растений. Процессинг интрона зависит от правильных 5' и 3' границ сплайсинга. Последовательности консенсуса для этих границ получены как для животных, так и для растительных мРНК, но только несколько нуклеотидов, как известно, инвариантны. Следовательно, трудно предсказать с какой-либо определенностью, является ли имеющаяся граница сплайсинга функциональной или частично функциональной, основываясь исключительно на анализе последовательности. В частности, инвариантными нуклеотидами являются только ГТ на 5' конце интрона и АГ на 3' конце интрона. У растений все четыре нуклеотида можно обнаружить либо внутри интрона, либо в экзоне, фланкирующем этот интрон (Brown John W., Nucleic Acids Research, 1986, v. 14, N 24, p.9549; Hanley B.A. and Schuler M.A., Nucleic Acids Research, 1988, v.16, N 14, p.7159).
Растительный интрон из гена пататина перемещали в ген GUS. Чтобы проделать это, проводили сайт-специфический мутагенез, чтобы ввести новые сайты рестрикции. Этот мутагенез изменял несколько нуклеотидов в интроне и последовательности экзона, фланкированных ГТ и АГ. Однако этот интрон еще функционировал правильно, указывая на важность ГТ и АГ и возможность замены в других нуклеотидных положениях. Имеется целый ряд случаев, когда ГТ и АГ в генах не функционируют как границы сплайсинга интрона, поэтому должна существовать некоторая другая последовательность или структурная черта, которая обозначает границы сплайсинга. При анализе растительных интронов и экзонов обнаружили, что экзоны имеют приблизительно 50% А+Т, в то время как интроны имеют приблизительно 70% А+Т (Wiebauer K. et al., 1988; Goodall G. et al., 1988, RNA Processing, Cold Spring Harbor Laboratory, p.63). Создан также искусственный растительный интрон, который имеет 5' и 3'консенсус границ сплайсинга и случайно А+Т богатую внутреннюю последовательность (Goodall G. et al. , 1988). Этот интрон сплайсировался в растениях правильно. Когда внутренний сегмент был замечен Г+Ц богатой последовательностью, эффективность сплайсинга очень значительно снизилась. Эти два примера демонстрируют, что узнавание интрона в растениях может зависеть от границ сплайсинга, которые имеют большое количество разнообразных последовательностей и наличие большого количества А+Т в самом интроне. Следовательно, довольно трудно предсказать на основании одной последовательности, функционирует ли эта отдельно взятая последовательность как активная для процессинга РНК или активным является отдельно взятый интрон.
Гены B.t., будучи А + Т богатыми, содержат многочисленные участки различной длины, которые имеют 70% или более А + Т. Количество таких участков, обнаруженных анализом последовательности, зависит от длины последовательности сканирования.
Следовательно, трудно предсказать, какие последовательности используются как сайты сплайсинга в любом данном гене. Многие, являющиеся природными гены имеют альтернативные пути сплайсинга, которые образуют альтернативные комбинации экзонов с конечной мРНК (Galltgo M.E. and Nadal-Ginard B., 1988, RNA Processing, Cold Spring Harbor Laboratory, p.61; Helfman D.M. and Ricci W.M. , 1988, RNA Processing, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 219; Tsurushita N. and Korn L.J., 1987, RNA Processing, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 215). То есть, некоторые границы сплайсинга, по-видимому, узнаются в одних обстоятельствах или в некоторых типах клеток, но не в других. Закономерности этого непонятны. В дополнение может существовать взаимодействие между путями процессинга, так что использование определенного сайта полиаденилирования может мешать сплайсингу в близлежащем сайте сплайсинга и наоборот (Adami G. and Nevins J., 1988, RNA Processing, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 26; Brady H. and Wold W., 1988, RNA Processing, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 224; Marzluff W. and Pandey N., 1988, RNA Processing, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 244). Например, в гене гормона роста быка небольшие делеции в экзоне (несколько сот нуклеотидов ниже интрона) вызывают падение эффективности сплайсинга с более чем на 95% до менее чем 2%. Другие делеции, однако, не оказывают существенного эффекта (Hampson R.K. and Roottman F.M., 1988, RNA Processing, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 68). В заключение, разнообразие экспериментов in vitro и in vivo показывает, что мутации, которые нарушают нормальный сплайсинг, ведут к быстрой деградации РНК в ядре. Сплайсинг в многоступенчатом процессе в ядре и мутации, не затрагивающие сплайсинг, могут приводить к блокировкам в процессе на целом ряде стадий. Любая из этих блокировок может затем вести к аномальной и нестабильной РНК. Изучение мутантов с нормально процессирующимися генами (полиаденилирование и сплайсинг) относится к изучению гетерологических генов, таких как гены B.t. Гены B. t. , возможно, содержат функциональные сигналы, которые приводят к образованию аберрантных нефункциональных мРНК, и эти мРНК, вероятно, нестабильны. Но гены B.t., возможно, содержат сигналы, которые аналогичны мутантным сигналам в природном гене. Как показано выше, эти мутантные сигналы, очень вероятно, вызывают дефекты в путях процессинга, что является следствием образования нестабильных мРНК.
С достаточной степенью определенности еще не известно, каковы сигналы терминации транскрипции РНК в растительных и животных клетках. Некоторые исследования генов животных указывают, что участки последовательности, богатой Т, вызывают терминацию РНК полимеразы II из тимуса теленка in vitro. Эти исследования показали, что 3' концы терминированных in vitro транскриптов часто лежат внутри блоков Т таких, как Т5, Т6 или Т7. Однако другие выявленные сайты терминации не состояли исключительно из Т, а имели один или более других нуклеотидов. Терминация, как было найдено, происходит внутри последовательностей ТАТТТТТТ, АТТЦТТ, ТТЦТТ (Dedrick R. et al., The Journal of Biological Chemistry, 1987, v.262, N19, pp. 909-1106; Reines D. et al., J. Mol. Biol., 1987, 196, pp. 299-312). В случае двух последних последовательность вдобавок является Ц + Т богатой. Другие исследования показывают, что потенциальные терминаторы транскрипции являются районами, богатыми А. Интересный пример по SV 40 иллюстрирует неопределенность определения терминаторов, основанного только на последовательности. Один из потенциальных терминаторов SV 40 был А богатым и содержал 5' район двойной симметрии (потенциальная петля-стебель) по отношению к А богатому участку. Однако второй терминатор, обнаруженный экспериментально ниже в том же гене, не был А богатым и не включал никакой потенциальной вторичной структуры (Kessler M. et al., 1988, RNA Processing, Cold Spring Harbor Laboratory, p.86). Гены B.t содержат участки, обогащенные А или Т, которые, по-видимому, могли бы действовать как терминаторы. С помощью описанного выше примера с глобиновым геном показана важность терминации для стабильности данной мРНК. Отсутствие нормального сайта полиА ведет к нарушению правильной терминации с последующим уменьшением количества мРНК.
Выявлено влияние на стабильность мРНК, которое обусловлено трансляцией мРНК. Преждевременная терминация трансляции в триозофосфатизомеразе человека приводит к нестабильности этой мРНК (Daar I.O. et al., 1988, RNA Processing, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 45). Другой пример (описанный выше) - глобиновая мРНК при бета-талассемии, которая специфически нестабильна в клетках костного мозга. Дефект в этом мутантном гене представляет собой делецию одной пары оснований в кодоне 44, что приводит к терминации трансляции (нонсенс кодон) в кодоне 60. По сравнению с правильно терминируемой нормальной глобиновой мРНК эта мутантная РНК очень нестабильна. Эти результаты показывают, что неправильно транслированная мРНК нестабильна. Другая работа на дрожжах показывает, что правильная, но слабая трансляция также может оказывать влияние на уровень мРНК. Гетерологичный ген модифицировали путем замены определенных кодонов на более предпочтительные в дрожжах кодонов. Наблюдали 10-кратное суммарное увеличение продукции белков, при этом было приблизительно 3-кратное снижение количества мРНК (Hoekema A. et al., Molecular and Cellular Biology, 1987, v.7, pp. 2914-2924). Это указывает на то, что более эффективная трансляция обеспечивает большую стабильность мРНК. Эффективное использование кодонов может происходить как на уровне РНК, так и на трансляционном уровне. Из изучения эффективности использования кодонов неясно, какие кодоны обеспечивают ослабление трансляции или как это соотносится со стабильностью мРНК.
Таким образом, техническим результатом изобретения является разработка способа получения синтетических растительных генов, которые экспрессируют соответствующие им белки на относительно высоких уровнях по сравнению с генами дикого типа и, в частности, получение синтетических растительных генов, которые экспрессируют кристаллический белковый токсин Bacillus thuringiensis на относительно высоких уровнях.
Фиг. 1 иллюстрирует стадии, использованные для модификации гена дикого типа с целью увеличения эффективности его экспрессии в растениях.
Фиг. 2-4 иллюстрируют сравнение модифицированной B.t.k. HD-1 последовательности по примеру 1 (нижняя линия) с последовательностью B.t.k.HD-1 дикого типа, которая кодирует кристаллический белковый токсин (верхняя линия).
Фиг. 5-7 иллюстрируют сравнение последовательности синтетического B.t.k. HD-1 по примеру 2 (нижняя линия) с последовательностью B.t.k. HD-1 дикого типа, которая кодирует кристаллический белковый токсин (верхняя линия).
Фиг 8-10 иллюстрируют сравнение последовательности синтетического B.t.k. HD-73 по примеру 3 (нижняя линия) с последовательностью B.t.k. HD-73 дикого типа (верхняя линия).
Фиг. 11 представляет физическую карту плазмиды интермедиата трансформации растений векторной кассетой pMON 893.
Фиг. 12 представляет физическую карту плазмиды интермедиата трансформации растений векторной кассетой pMON 900.
Фиг. 13 представляет карту для лишенной концов Т-ДНК А. tumefaciens АСО.
Фиг. 14-16 иллюстрируют сравнение синтетического усеченного гена B.t.k. HD-73 (аминокислоты 29-615 c N-концевым Met-Ala) по примеру 3 (нижняя линия) по сравнению с последовательностью B.t.k. HD-73 дикого типа (верхняя строчка).
Фиг. 17-21 иллюстрируют сравнение последовательности полноразмерного синтетического гена дикого типа B.t.k. HD-73 (нижняя линия) по примеру 3 с последовательностью полноразмерного B.t.k. HD-73 дикого типа (верхняя строчка).
Фиг. 22-26 иллюстрируют сравнение полностью синтетической полноразмерной последовательности B. t. k. HD-73 по примеру 3 (нижняя строчка) с полноразмерной последовательностью дикого типа B.t.k. HD-73 (верхняя строчка).
Фиг. 27-31 иллюстрируют сравнение полностью синтетической полноразмерной последовательности B. t. k. HD-73 по примеру 3 (нижняя строчка) с полноразмерной последовательностью дикого типа B.t.k. HD-73 (верхняя строчка).
Фиг. 32-34 иллюстрируют сравнение синтетической B.t.t. последовательности по примеру 5 (нижняя строчка) с последовательностью B.t.t. дикого типа, которая кодирует кристаллический белковый токсин (верхняя строчка).
Фиг. 35-37 иллюстрируют сравнение синтетической последовательности B.t. Р2 по примеру 6 (нижняя линия) с последовательностью дикого типа B.t.k. HD-1, которая кодирует белковый токсин (верхняя строчка).
Фиг. 38-42 иллюстрируют сравнение синтетической последовательности B.t. entomocidus по примеру 7 (нижняя строчка) с последовательностью дикого типа B.t. entomocidus, которая кодирует белковый токсин Бтента (верхняя линия).
Фиг. 43 иллюстрирует физическую карту растительного экспрессионного кассетного вектора pMON 744.
Фиг. 44 иллюстрирует сравнение последовательности белка оболочки (синтетической) roll-вируса листьев картофеля PLRV по примеру 9 (нижняя строчка) с последовательностью белка оболочки дикого типа PLRV (верхняя строчка).
Настоящее изобретение раскрывает способ получения синтетических растительных генов, которые экспрессируют белковый продукт на уровнях значительно выше, чем гены дикого типа, которые обычно использовали для трансформации до сих пор. Кроме того, в настоящем изобретении также описаны новые синтетические растительные гены, которые кодируют нерастительные белки.
В частности, в материалах заявки раскрыто получение синтетических растительных генов, которые кодируют кристаллический белковый токсин Bacillus thiringiensis (B.t.). Подходящие подвиды B.t. включают, но не ограничиваются только B. t. kurstaki HD-1, B.t. kurstaki HD-73, B.t. sotto, B.t. berliner, B.t. thuringiensis, B.t. tolworthi, B.t. dendrolimus, B.t. alesti, B.t. galleriae, B.t. aizawai, B.t. subtoxicus, B.t. entomocidus, B.t. tenebrionis и B.t. san diego.
Однако следует особо подчеркнуть, что настоящий метод может использоваться для получения синтетических растительных генов, которые кодируют нерастительные белки, другие, чем кристаллический белковый токсин B.t., так же, как и растительные белки (см. для примера пример 9).
Экспрессия генов B.t в растениях проблематична. Об экспрессии генов B.t. в растениях с уровнями, обладающими инсектицидным действием, сообщалось ранее. В частности, экспрессия полноразмерного специфического гена липидоптерана B.t. (ДНК выделена из B.t.k.) оказалась неуспешной для достижения уровней экспрессии, обладающих инсектицидной активностью, в некоторых видах растений (Vaeck M. et al., Nature, 1987, v.328, p.33; Barton K.A. et al., Plant Physiol., 1987, 85, 1103-1109).
Сообщалось, что экспрессию полноразмерного гена из B.t.r.HD-1 детектировали в томатах, но что усеченные гены приводили к более высокой частоте растений с более высоким общим уровнем экспрессии, обладающим инсектицидным действием. Усеченные гены B.t. berliner также обеспечивали получение большего количества растений табака, обладающих инсектицидной активностью (Vaeck M. et al., 1987). С другой стороны, растения салата, которые развивались из трансформантов с полноразмерным геном, обладали инсектицидной активностью.
Также сообщалось, что полноразмерный ген из B.t.k. HD -73 обеспечивал инсектицидный эффект в табаке (Adang et al., Molecular Strategies for Crop Protection, 1987, pp. 345-353). Однако мРНК B.t., обнаруженная в этих растениях, имела размер 1,7 тпн по сравнению с ожидаемой 3,7 тпн, указывая на неправильную экспрессию гена. Полагают, что эта усеченная мРНК слишком коротка, чтобы кодировать функционально активный усеченный токсин. По-видимому, на низком уровне в некоторых растениях должна существовать более длинная мРНК или же не должно было наблюдаться инсектицидной активности. Другие авторы сообщали, что они наблюдали значительное количество мРНК, длина которых короче ожидаемой (усеченный B.t.k. ген), но некоторые мРНК имели ожидаемую длину. Действительно полагают, что возможна экспрессия полноразмерного гена токсина в каллюсе табака (Barton K.A. et al., 1987). Вышесказанное иллюстрирует, что гены типа липидоптерана B.t. слабо экспрессируются в растениях по сравнению с другими химерными генами, экспрессируемыми с тех же кассетных промоторов.
Экспрессия B.t.t. в томатах и картофеле происходит на уровнях, подобных B. t.k. (то есть, бедных). B.t.t. и B.t.k. гены имеют ограниченную гомологию последовательности, но у них много общих черт (в частности, нуклеотидный состав и наличие специфических А+Т богатых элементов).
Итак, все сообщения в этой области отмечали наличие ожидаемой экспрессии генов B. t. в растениях. В целом, инсектицидная эффективность измерялась с помощью насекомых, очень чувствительных к B.t. токсину, таких как табачная бабочка-бражник. Хотя удавалось получить растения, полностью защищенные от табачной бабочки-бражника, важно заметить, что бабочка-бражник является в 500 раз более чувствительной к токсину B.t., чем некоторые агрономически важные насекомые-вредители, такие как совка-карадрина. Следовательно, необходимо получать трансгенные растения, которые защищены от всех важных липидоптерных вредителей (или от колорадского жука в случае B.t. tenebrionis) с безопасным уровнем экспрессии B.t. сверх эффективного защитного уровня. Важно создать растительные гены, которые воспроизводимо функционируют в разных видах растений, чтобы можно было предсказать получение устойчивых к насекомым растений.
Для того, чтобы достигнуть этих целей, необходимо понимать природу более низкой экспрессии, чем ожидаемая, генов B.t. в растениях. Уровень стабильной мРНК B.t. в растениях гораздо ниже ожидаемого. То есть, по сравнению с другими кодирующими последовательностями, направляемыми тем же промотором, уровень м РНК B.t., измеренный норзерн-анализом или анализом с защитной от нуклеаз, гораздо ниже. Например, растение томата 337 (Fischhoff D.A. et al., Biotechnology, 1987, v. 5, p. 807) было отобрано как растение, лучше всех экспрессирующее ген B.t. из плазмиды pMON 9711, содержащий Kpn1 фрагмент B. t. k. HD-1, читаемый с CaMV 35S промотора и селектируемый маркерный ген NOS-NPTII-NOS. В этом растении уровень мРНК B.t. примерно в 100 и 1000 раз ниже, чем уровень мРНК NPTII, хотя CaMV 35S промотор приблизительно в 50 раз сильнее, чем NOS промотор (Sanders P.R. et al., Nucleic Acids Research, 1987, v. 15, N 4, p. 1543).
Уровень белкового токсина B.t., обнаруженный в растениях, при этом согласуется с низким уровнем мРНК B.t. Более того, инсектицидная эффективность трансгенных растений коррелирует с содержанием белка B.t., подтверждая тот факт, что белок токсина, продуцируемый в растениях, биологически активен. Следовательно, низкий уровень экспрессии токсинов B.t. является результатом низких уровней мРНК B.t.
Количество матричной РНК определяется скоростью синтеза и скоростью деградации. Имеется баланс между этими двумя величинами, который определяет устойчивый постоянный уровень мРНК. При использовании промотора GMV 35S скорость синтеза является максимальной. Использование других растительных промоторов, таких как промотор нопалинсинтазы (NOS), маннопинсинтазы (MAS) и рибулозобифосфаткарбоксилазы малой субъединицы (RUBISSO), не меняли уровень экспрессии белкового токсина B.t., указывая тем самым, что эффекты, определяющие уровень экспрессии белкового токсина B.t., не зависят от промотора. Эти данные подразумевают, что последовательности ДНК генов, кодирующих белковые токсины B.t., каким-то образом ответственны за уровень низкой экспрессии и что этот эффект проявляется в низком уровне аккумулируемой стабильной мРНК.
Ниже ожидаемых уровни мРНК наблюдали в случае четырех различных специфических генов лепидоптерана (два из B.t.k. HD-1, B.t. berliner и B.t.k. HD-13), также как и в случае использования специфичного для жуков гена B.t. tenebrionis. По-видимому, в генах B. t. лепидоптерного типа эти влияния проявляются более сильно в полноразмерных кодирующих последовательностях, чем в усеченных кодирующих последовательностях. Эти эффекты наблюдаются у всех растительных видов, хотя их значение кажется большим в некоторых растительных видах, таких как табак.
Природа кодирующих последовательностей генов B.t. отличается от растительных генов. В частности, гены B.t. очень богаты (приблизительно 62%) аденином (А) и тимином (Т), в то время как растительные гены и большинство бактериальных генов, которые экспрессированы в растениях, имеют порядка 45-55% А+Т. Содержание А+Т в геноме (таким образом и в гене) любого организма - отличительная черта этого организма и отражает его эволюционную историю. В то время как гены одного организма имеют сходный А+Т состав, этот состав может сильно варьировать от организма к организму. Например, некоторые виды Bacillus имеют более А+Т богатые гены, в то время как некоторые виды Streptomyces имеют менее А+Т богатые геномы (от 30 до 35% А+Т).
Из-за "избытка" А+Т в структурных кодирующих последовательностях, обусловленного вырожденностью генетического кода и ограниченным числом кодонов, выбранных для аминокислоты, некоторые из видов Bacillus находятся в третьей позиции кодонов. То есть, гены некоторых видов Bacillus имеют А или Т как третий нуклеотид во многих кодонах. Таким образом, А + Т состав частично может предопределять предпочтительное использование кодонов. Ясно, что эволюция гена направлена на максимальное их функционирование в организме. Это означает, что отдельные нуклеотидные последовательности, находящиеся в каком-либо гене одного организма, где они не играют никакой роли, за исключением кодирования на определенном участке аминокислот, узнаются в качестве генетических контролирующих элементов в другом организме (например, промоторами транскрипции или терминаторами, сайтами поли А, сайтами сплайсинга интронов или сигналами деградации специфической мРНК). Возможно неправильное прочтение сигналов не является общей чертой экспрессии гетерологичных генов, но это можно частично объяснить относительно гомогенным А+Т составом (приблизительно 50%) многих организмов. Этот А + Т состав плюс природа генетического кода соответствуют любой отдельной олигонуклеотидной последовательности. Таким образом, ген из E.coli с 50% А + Т составом гораздо в меньшей степени содержит отдельный сегмент, богатый А + Т, чем ген из B.thuringiensis.
Как описано выше, экспрессия белкового токсина B.t. в растениях проблематична. Хотя наблюдения, сделанные в других системах, позволяют предсказать возможность увеличения уровня экспрессии белковых токсинов B.t. в растениях. Однако успех заявленного способа является неожиданным. Действительно, в большом количестве работ в последние годы отмечается, что экспрессия полноразмерного белкового токсина B.t.k. в табаке вызывает отмирание каллюсной ткани (Barton K. A. et al., 1987). Следовательно, разумно было бы ожидать, что высокий уровень экспрессии белкового токсина недостижим из-за токсических эффектов.
Согласно изобретению способ включает модификацию существующей структурной кодирующей последовательности ("структурного гена") путем удаления последовательностей АТТТА и имеющихся сигналов полиаденилирования с помощью сайт-специфического мутагенеза ДНК, включающей структурный ген. Предпочтительно, чтобы фактически все сигналы полиаденилирования и последовательности АТТТА были удалены, хотя большие уровни экспрессии наблюдаются и при частичном удалении каждой из выше определенных последовательностей. Альтернативно, если получен синтетический ген, кодирующий и обеспечивающий экспрессию белка, кодоны выбираются таким образом, чтобы избежать АТТТА последовательности и имеющиеся сигналы полиаденилирования. При этом сигналы полиаденилирования включают, но не ограничиваются ААТААА, ААТААТ, ААССАА, АТАТАА, ААТСАА, АТАСТА, АТАААА, ATGAAA, AAGCAT, ATTAAT, ATACAT, AAAATA, AATTAAA, AATTAA, AATACA и CATAAA.
При замене последовательностей АТТТА и сигналов полиаденилирования используются предпочтительно те кодоны, которые не являются редко встречаемыми в растительном геноме.
Другое воплощение изобретения, представленное на фиг. 1, предполагает использование метода для модификации существующего структурного гена или альтернативного метода синтеза de novo структурного гена, который является менее строгим, чем метод, описанный выше. При этом выбранная последовательность ДНК сканируется для того, чтобы выявить районы, содержащие более четырех последовательных адениновых (А) или тиминовых (Т) нуклеотидов. А+Т районы сканируют на потенциальные сигналы полиаденилирования растений. Как правило, удаление пяти или более последовательных А или Т нуклеотидов элиминирует большинство растительных сигналов полиаденилирования. Однако, если выявляют более чем один минорный сигнал полиаденилирования, найденный внутри десяти нуклеотидов другого сигнала, тогда нуклеотидную последовательность этого района предпочтительно изменять, чтобы удалить эти сигналы, сохраняя при этом оригинальную аминокислотную последовательность.
Далее следует вторая стадия - принять во внимание 15-30 нуклеотидные районы, окружающие A + T богатые участки, определенные на первой стадии. Если содержание A + T в окружающем районе меньше, чем 80%, он должен быть проверен на наличие сигналов полиаденилирования. Изменение района в случае обнаружения в нем сигналов полиаденилирования зависит от количества присутствующих сигналов полиаденилирования и от присутствия мажорного растительного сигнала полиаденилирования.
Протяженный район исследуют на присутствие растительных сигналов полиаденилирования. Сигналы полиаденилирования удаляют сайт-специфическим мутагенезом последовательности ДНК. Кроме того, район также исследуют на мультикопийность последовательности ATTTA, которая также удаляется с помощью мутагенеза.
Предпочтительно, чтобы районы, включающие много последовательных A + T оснований или Г + Ц оснований, нарушались, так как эти районы способны с большей вероятностью формировать структуру шпильки, которая обусловлена полукомплементарностью. Следовательно, встраивание гетерогенных нуклеотидов уменьшает вероятность формирования полукомплементарной вторичной структуры, которая, как известно, ингибирует транскрипцию и/или трансляцию в некоторых организмах. В некоторых случаях этот вредный эффект может быть сведен к минимуму с использованием последовательностей, которые не содержат более пяти последовательных А + Т или Г + Ц.
Синтетические олигонуклеотиды для мутагенеза.
Олигонуклеотиды, используемые в мутагенезе, предназначены для сохранения правильной аминокислотной последовательности, правильной рамки считывания и особенно для того, чтобы не вводить сайты рестрикции, такие как BglII, HindIII, SacI, KpnI, EcoRI, NcoI, PstI и SalI в модифицированный ген. Эти сайты рестрикции находятся среди инсерционных сайтов полилинкера клонирующих векторов, таких как плазмиды pUC 118 и pMON 7258. Конечно, следует также избегать введения новых сигналов полиаденилирования, АТТТА последовательности или районов, содержащих по более чем пять последовательных А + Т или Г + Ц. Предпочтительно использовать олигонуклеотиды размером около 40-50 оснований, но в ряде случаев использовали фрагменты, имеющие размер от 18 до 100 оснований. В большинстве случаев сохраняют минимум от 5 до 8 пар оснований, гомологичных образцу ДНК, на обоих концах синтезированного фрагмента для того, чтобы обеспечить правильную гибридизацию данного праймера с образцом (матрицей). В олигонуклеотидах следует избегать последовательности оснований А + Т или Г + Ц длиною более чем 5 пар. В кодонах, использованных для замены кодонов дикого типа, следует предпочтительно, где это возможно, избегать ТА или ГЦ дуплета. Концы отбирают из табл.2 предпочтительных растительных кодонов так, чтобы избежать кодонов, которые редко встречаются в растительных геномах. Необходимо сделать попытку отобрать кодоны, предпочтительно содержащие около 5% Г + Ц состава.
Как уже отмечалось, считают, что районы с многочисленными последовательными А + Т или Г + Ц основаниями обладают большей способностью формировать шпилечные структуры, обусловленные полукомплементарностью. Изменение этих районов в результате инерции гетерогенных пар оснований наиболее предпочтительно и должно уменьшать сродство при формировании полукомплементарных вторичных структур, таких как шпильки, которые, как известно, в некоторых организмах ингибируют транскрипцию (транскрипционные терминаторы) и трансляцию (аттенуаторы). Однако трудно предсказать биологический эффект района, формирующего потенциальную шпильку.
Для тех, кто квалифицирован в данной области, очевидно, что в то время как вышеуказанное описание раскрывает модификацию последовательностей ДНК генов данного типа, данный метод можно использовать и для конструирования целого синтетического гена, кодирующего определенную аминокислотную последовательность. Следует избегать районов с пятью или более последовательных А + Т или Г + Ц нуклеотидов. Где это возможно, следует отбирать кодоны, избегая ТА и ГЦ дуплетов. Рекомендуется использовать предпочтительные для растений кодоны и кодоны Г + Ц, состав которых предпочтительно равен 50%. Результирующую последовательность следует проверить, чтобы убедиться в том, что в ней присутствует минимальное количество растительных сигналов полиаденилирования и последовательностей АТТТА. Сайты рестрикции, обычно используемые в клонирующих векторах, также предпочтительно избегать. При этом наличие нескольких уникальных сайтов рестрикции на всем протяжении гена полезно для анализа экспрессии гена или конструирования вариантов гена.
Растительные генные конструкции.
Экспрессия растительного гена, которая осуществляется на двухцепочечной ДНК, включает транскрипцию матричной РНК (мРНК) с одной цепи ДНК с помощью фермента РНК полимеразы и последующий процессинг первичного мРНК транскрипта внутри ядра. Этот процессинг предполагает использование 3' нетранслируемого района, который содержит сигнал полиаденилирования. Транскрипция ДНК в мРНК регулируется районом ДНК, который обычно называют "промотор". Промоторный район содержит последовательность оснований для связывания РНК полимеразы с ДНК и инициирования транскрипции мРНК в результате использования одной из цепей ДНК как матрицы для создания соответствующей цепи РНК.
Целый ряд промоторов, которые являются активными в растительных клетках, описаны в литературе. Они включают промоторы нопалинсинтазы (NOS) и октопинсинтазы (OCS)(которые несут опухолевоиндуцируемые плазмиды Agrobacterium tumefaciens), вируса мозаики цветной капусты (CaM V) 19S и 35S, индуцируемый светом промотор из малой субъединицы рибулозофосфаткарбоксилазы (ss RUBISCO) и промотор маннопинсинтазы (MAS)(Velten et al., EMBO J., 1984, 3: 2723-2730; Velten and Schell, Nucleic Acids Research, 1985, 13: 6981-6998). Все эти промоторы использовали для создания различных типов конструкций ДНК, которые экспрессировались в растениях (см. PCT W 084/02913).
Промоторы, которые обеспечивают транскрипцию РНК в растительных клетках, можно использовать в настоящем изобретении. Такие промоторы можно получить из растений или растительных вирусов и включают, но не ограничиваются, промотором CaMV 35S и промотором, выделенным из растительных генов, таких как гены ss RUBISCO. Как описано ниже, предпочтительно, чтобы отдельно выбранный промотор обеспечивал эффективную экспрессию, вызывая продукцию достаточного количества белка.
Промоторы, использованные в конструкциях ДНК (химерные растительные гены) настоящего изобретения, можно модифицировать по желанию, чтобы повлиять на их контрольные характеристики. Например, промотор CaMV 35S можно лигировать с частью гена ss RUBISCO, который подавляет экспрессию ss RUBISCO в отсутствии света для того, чтобы создать промотор, который активен в листьях, но не в корнях. Результирующий химерный промотор можно использовать в изобретении.
В описании введены следующие обозначения: "CaMV 35S" промотор, таким образом, включает вариации промотора CaMV 35S, например промоторы, образованные посредством лигирования с районами оператора. Более того, промоторы можно изменять для создания многочисленных "энхансерных последовательностей", чтобы облегчить повышенную экспрессию гена.
РНК, транслируемая с конструкции ДНК, раскрытой в изобретении, также содержит 5' нетранслируемую лидерную последовательность. Эта последовательность может происходить из промотора, отобранного для экспрессии данного гена, и может быть специально модифицированной для того, чтобы увеличить трансляцию мРНК. 5' нетранслируемые районы могут также быть получены из вирусных РНК, из подходящих эукариотических генов или из последовательности синтетического гена. Настоящее изобретение не ограничено конструкциями, раскрытыми в нижеследующих примерах. Нетранслируемая лидерная последовательность может быть частью 5' конца нетранслируемого района кодирующей последовательности белка оболочки вируса или частью промоторной последовательности, или может происходить из неродственного промотора или кодирующей последовательности. В любом случае предпочтительно, чтобы последовательность, фланкирующая сайт инициации, соответствовала правилам консенсуса трансляционной последовательности для усилении инициации трансляции (Kozak M., Nature, 1984, 308: 241-246).
Конструкция ДНК настоящего изобретения также содержит модифицированную или полностью синтетическую структурную кодирующую последовательность, которую изменили для усиления действия этого гена в растениях. В частности, конструировали модифицированные или полностью синтетические гены, кодирующие кристаллический белковый токсин Bacillus thuringiensis.Структурные гены настоящего изобретения могут также кодировать слитый белок, включающий аминотерминальный транспортный пептид хлоропластов или секреторную сигнальную последовательность (см. примеры 10 и 11).
Конструкция ДНК также содержит 3' нетранслируемый район, 3' нетранслируемый район содержит сигнал полиаденилирования, который функционирует в растениях, чтобы вызвать присоединение полиаденилат нуклеотидов к 3' концу вирусной РНК. Примерами подходящих 3' районов являются (1) 3' транскрибируемые, нетранслируемые районы, содержащие сигнал полиаденилирования Agronacterium, из опухолевоиндуцируемых генов плазмиды (Ti), такие как ген нопалинсинтазы (NOS), и (2) растительные гены, подобные генам запасных белков соевых бобов (7S) и генам малой субъединицы RuBP карбоксилазы (E9). Предпочтительным 3' районом является район гена 7S.
Трансформация растительных клеток.
Растительный химерный ген, содержащий структурную кодирующую последовательность настоящего изобретения, можно ввести в геном растения любым подходящим методом. Подходящими растениями для использования в практике настоящего изобретения являются, но не ограничиваются ими, соевые бобы, хлопчатник, люцерна, масличное семя льна, томаты, сахарная свекла, подсолнечник, картофель, табак, кукуруза, рис и пшеница. Подходящие для трансформации растительные векторы включают векторы, происходящие из Ti плазмиды Agrobacterium tumefaciens, и другие (Herrera-Estrella L. et al., Nature, 1983, 303: 209; Bevan M.et al., Nature, 1983, 304: 184; Klee H.J. et al., Bio/Technology, 1985, 3: 637-642; EPO 120,516).
В дополнение к векторам для трансформации растительных клеток, происходящим от Ti или Ri плазмид Agrobacterium, могут использоваться альтернативные методы для включения конструкций ДНК этого изобретения в растительные клетки. Такие методы предполагают, например, использование липосом, электропорации, веществ, которые увеличивают принятие свободной ДНК, доставки свободной ДНК посредством микропулевой бомбардировки и трансформации с помощью вирусов или пыльцы.
Пригодный для трансформации двудольных растений Ti плазмидный кассетный вектор показан на фиг. 11. Экспрессионная кассета pMON 893 состоит из CaMV 35S промотора (EN 35S) и 3' конца, включающего сигналы полиаденилирования гена соевых бобов, кодирующего главную альфа-субъединицу бета-конглицинина. Между этими двумя элементами находится полилинкер, содержащий множественные рестрикционные сайты для инсерции генов.
Стимулированный CaMV 35S промотор конструировали следующим образом. Фрагмент промотора CaMV 35S, простирающегося между положениями -343 и +9, предварительно встраивали в pUC13 (Odell J. et al., Nature, 1985, 313: 810). Этот сегмент включает один район, обнаруженный Odell et al., (1985) и необходимый для максимальной экспрессии CaMV 35S промотора. Его выделяли на ClaI-HindIII фрагменте, делали тупыми концы этого фрагмента с помощью ДНК полимеразы I (фрагмент Кленова) и вставляли в Hincll сайт (pUC.18). Далее этот промотор 35S выделяли из плазмиды на HindIII-EcoRV фрагменте (протяженностью от -343 до -90) и вставляли в ту же плазмиду между HindII и PstI сайтами. Усиленный CaMV 35S промотор, таким образом, содержит дупликацию последовательностей между -343 и -90 (Kay R. et al., Science, 1987, 236; 1299-1302).
3' конец гена 7S получали из гена 7S, содержащегося в клоне, обозначенном 17.1 (Schuler M.A. et al., Nucleic Acids Research, 1982, v.10, N24, pp. 8225-8244). Этот 3' концевой фрагмент, который включает сигналы полиаденилирования, тянется от AvaII сайта, локализованного около 30 пн выше кодона терминации для гена бета-конглицинина, до EcoRI сайта, локализованного около 450 пн ниже этого кодона терминации в клоне 17.1.
Оставшаяся часть плазмиды pMON 893 содержит фрагмент pBR 322, который обеспечивает начало репликации в E.coli, и район гомологичной рекомбинации с "разоруженной" Т-ДНК штамма Agrobacterium ACO (описанного ниже), oriV район из плазмиды RKI с широким кругом хозяев, ген устойчивости к стрептомицину (спектиномицину из Tn 7) и химерный NPTII ген, содержащий CaMV 35S промотор и 3' конец нопалинсинтазы (NOS), которая обеспечивает устойчивость трансформированных растительных клеток к канамицину.
Вектор pMON 900 является производным pMON 893. Усиленный CamV 35S промотор pMON 893 заменен на промотор 1,5 тпн маннопинсинтазы (MAS) (Velten et al. , 1984). Другие сегменты были такими же, как у pMON 893. После введения конструкции ДНК в плазмидный вектор pMON 893 или pMON 900 полученным интермедиатным вектором трансформируют A.tumefaciens штамм ACO, который включает "разоруженную" (то есть, неонкогенную) Ti плазмиду. Коинтегрировавшие Ti плазмидные векторы были отобраны и использованы для трансформации двудольных растений.
На фиг. 13 представлен A.tumefaciens- "разоруженный" штамм, подобный pTiB6SE (Fraley R.T. al., Bio/Technolоgy, 1985, 3: 629-635). Для конструирования ACO штамма используют начальный штамм Agrobacterium A208, который содержит TI плазмиду нопалинового типа. Ti плазмида была "разоружена" подобно тому, как описано у Fraley R.T. et al., (1985) так, чтобы существенно все нативные Т-ДНК были удалены, за исключением левой границы и нескольких сот пар оснований Т-ДНК внутри левой границы. Остаток Т-ДНК, распространяющийся до точки сразу за правой границей, заменяли новым куском ДНК, включающим (слева направо) фрагмент pBR 322, Ori V район из плазмиды RK2 и ген устойчивости к канамицину из Tn 601. pBR 322 и Ori V фрагменты подобны фрагментам pMON 893 и обеспечивают район гомологии для образования коинтеграта.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Модифицированный B.t.k. HD-1 ген.
Ген B. t. k. HD-1 дикого типа, как известно, слабо экспрессируется в растениях независимо от того, является ли он полноразмерным геном или усеченным геном. Ген B.t.k. содержит много A + T богатых районов потенциальных сайтов полиаденилирования (16 сайтов, см. список последовательностей) и многочисленные последовательности ATTTA.
Список последовательностей потенциальных сайтов полиаденилирования:
AATAAA* - AAGCAT
AATAAT* - ATTAAT
AACCAA - ATACAT
ATATAA - AAAATA
AATCAA - ATTAAA**
ATACTA - AATTAA**
ATAAAA - AATACA**
ATGAAA - CATAAA**
* Указывает мажорный потенциальный сайт полиаденилирования для растений.
** Указывает минорный потенциальный сайт полиаденилирования для животных.
Все остальные - потенциальные минорные сайты полиаденилирования для растений.
В табл. 3 перечислены синтетические олигонуклеотиды, предназначенные и синтезированные для сайт-специфического мутагенеза B.t.k. HD-1 гена. B.t.k HD-1 ген (BglII фрагмент из pMON 9921, кодирующий аминокислоты 29-607 с Met-Ala на N- конце) клонировали в BglII сайт pMON 7258 (pUC 118 производное, которое содержит BglII сайт в клонирующем районе полилинкера), образуя pMON 5342. Ориентация B.t.k. гена выбиралась такая, чтобы для мутагенеза синтезировалась цепь противоположной ориентации (негативная цепь) в нитевидных фаговых частицах. Для мутагенеза использовали процедуру Кункеля (Kunkel T.A. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, v.82 pp. 488-492) и плазмиду pMON 5342 в качестве стартового материала.
Районы мутагенеза отбирали следующим образом. Идентифицировали районы последовательности ДНК B.t.k. гена, которые содержат пять или более последовательных A или T пар оснований. Они были распределены по длине и в порядке большего процента A + T в окружающих последовательностях в пределах района в 20-30 пар оснований. Затем ДНК анализировали на районы, которые могут содержать сайты полиаденилирования (см. выше список последовательностей потенциальных сайтов полиаденилирования) или последовательности ATTTA. Применяли олигонуклеотиды, которые обеспечивали наивысшую элиминацию A + T в непрерывных районах, которые содержали один или более сайтов полиаденилирования или ATTTA последовательностей. Два потенциальных сайта полиаденилирования растений были оценены более критически (см. выше список последовательностей потенциальных сайтов полиаденилирования), основываясь на опубликованных сообщениях. Выявляли кодоны с увеличенным Г + Ц составом, которые не образовывали сайтов рестрикции, полезных для клонирования и сборки модифицированного гена (BamHI, BglII, SacI, NcoI, EcoBV и не содержали дуплетов ТА или ГЦ, о которых сообщалось, что они не часто встречаются в кодонах у растений. Используемые нуклеотиды имели длину по меньшей мере от 18 до 100 пар оснований и содержали по меньшей мере 5-8 пар оснований, которые обладали гомологией с нативными последовательностями на концах фрагментов для эффективной гибридизации и праймирования в реакциях сайт-специфического мутагенеза. На фиг. 2-4 сравнивается последовательность гена B.t.k.HD-1 дикого типа с последовательностью, которая получилась при ее модификации сайт-специфическим мутагенезом.
Конечный результат этих замен привел к увеличению Г + Ц содержания в гене B.t.k. с 37% до 41%, а также к уменьшению количества потенциальных сайтов полиаденилирования для растений с 18 до 7 и уменьшению количества ATTTA районов с 13 до 7. Детально проведенные замены с аминоконцевого (5') по карбоксильный (3') концы являются следующими.
ВТК185 - 18-мер, использованный для элиминации растительного сайта полиаденилирования в середине района из девяти пар оснований A + T.
ВТК240 - 48-мер. Семь пар оснований были замены этим олигонуклеотидом, чтобы элиминировать три потенциальных сайта полиаденилирования (2 ААЦЦАА, 1 ААТТА). Еще один район, расположенный рядом с ВТК240, начинался с 312 пн, имел высокий А + Т состав (13 из 15 пар нуклеотидов) и АTТТА район. Однако он не содержал потенциального сайта полиаденилирования и его самый длинный непрерывающийся А + Т ряд равен семи парам нуклеотидов.
ВТК462 - 54-мер, вводящий 13 пн замен. Первые шесть замен осуществлялись, чтобы уменьшить количество А + Т в данном гене в результате замены кодонов дикого типа на кодоны, содержащие Г или Ц, избегая дуплетов ЦГ. Следующие семь замен, сделанных ВТК462, использовали, чтобы элиминировать А + Т богатый район (13 из 14 пар нуклеотидов были А или Т), содержащий два АТТТА района.
ВТК669 - 48-мер, делающий девять индивидуальных нуклеотидных замен, элиминирующих три возможных сайта полиаденилирования (АТАТАА, ААТЦАА и ААТТАА) и одиночный АТТТА сайт.
ВТК930 - 39-мер, предназначенный для увеличения Г + Ц состава и элиминации потенциального сайта полиаденилирования (ААТААТ - мажорный сайт). Этот район не содержал девяти пар оснований непрерывной А + Т последовательности. Поэтому одна из нуклеотидных замен была с Г на А, так как Г в этой позиции мог бы создать Г + Ц богатый район (ЦЦГГ(Г)Ц). В результате сиквенса было установлено, что могут возникнуть трудности образования последовательности из-за непрерывных Г + Ц пар и будет благоразумно избежать образования потенциально проблематичных районов, даже если они проблематичны только in vitro.
ВТК1110 - 32-мер, предназначенный для введения пяти замен в ген дикого типа. Один потенциальный сайт (ААТААТ - мажорный сайт) элиминировали в середине А + Т богатого района (19 из 22 пар оснований).
ВТК1380Ф и ВТК1380Т ответственны за 14 индивидуальных нуклеотидных замен. Первый район (1380А) имеет 17 непрерывных А + Т пар оснований. Кроме того, в этом районе находится АТТТА и потенциальный сайт полиаденилирования (ААТААТ). 100-мер (1380Т) содержит все замены, предписываемые 1380А. Большой размер этого праймера был предложен для экспериментального определения, можно ли использовать большие олигонуклеотиды для мутагенеза (выше 60 нуклеотидов длиной). Кроме того, 100-мер использовали для мутагенеза матрицы, которая предварительно подвергалась мутагенезу с 1380А. Первоначальный праймер, предназначенный для мутагенеза в районе, расположенном ниже или прилежащем к 1380А району, эффективно не отжигался с желаемым местом. Наличие большого района гомологии в 1380Т допускало правильный отжиг. Большой размер 1380Т был более удобным. Второй район, прилежащий к 1380А (1380Т), имеет высокий А + Т состав (из 29 нуклеотидов 22 нуклеотида А или Т).
ВТК1600 - 27-мер, ответственный за пять индивидуальных замен пар оснований. АТТТА район и сайт полиаденилирования для растений были идентифицированы и сделаны соответствующие замены.
Все 62 основания были заменены сайт-направленным мутагенезом. При этом Г + Ц состав увеличился на 55 пар оснований, были сокращены потенциальные сайты полиаденилирования от 18 до семи и уменьшено число АТТТА последовательностей с 13 до семи. Мутации в последовательности ДНК привели к заменам в 55 из 579 кодонов в усеченном B.t.k. гене в pMON 5342 (приблизительно 9,5%).
В табл.4 показано, что модифицированные B.t.k. HD-1 гены конструировали так, чтобы они содержали все вышеперечисленные модификации (pMON 5370) или различные наборы индивидуальных модификаций. Эти гены встраивали в pMON 893 для трансформации растений. Растения табака, содержащие эти гены, подергали анализу. Анализ растений табака, содержащих индивидуальные модификации, предпринимали по нескольким причинам. Усеченный ген дикого типа в табаке экспрессируется очень слабо, что приводит к редкой идентификации растений, устойчивых к THW. Токсичность определяли в результате анализа съеденных листьев как по меньшей мере 60% смертность гусениц 1-го возраста бабочки-бражника со степенью повреждения от 1 или менее (шкала от 0 (полная защита) до 4 (полная гибель). Модифицированный HD-1 ген (pMON 5370) демонстрирует увеличение экспрессии, которая оценена приблизительно как 100-кратная (см. табл.8) в табаке. Следовательно, увеличение экспрессии гена дикого типа, обусловленное индивидуальными модификациями, по-видимому, сильно увеличивает частоту токсичных для насекомых растений табака. Результаты показаны в табл.4.
Эффекты индивидуальных олигонуклеотидных замен на экспрессию имели некоторые общие тенденции. Создали различные конструкции, предназначенные для идентификации ключевых районов. Девять различных олигонуклеотидов разделили пополам по их позиции в данном гене. Замены в N-терминальной части объединили в pMON 10707 (185, 240, 462, 668). Замены C-терминальной части объединили в pMON 10706 (930, 1110, 1380a+b, 1600). Результаты анализа растений в этих двух конструкциях указывают, что pMON 10707 продуцирует существенное количество токсичных для насекомых растений (19 из 48). Белок из этих растений детектировали ELIZA анализом. Растения, содержащие pMON 10706, были идентифицированы как чувствительные к насекомым (1 из 43), и уровни экспрессии белка B. t.k. детектировались иммунологическим анализом очень скудно. Исследование N-терминальных замен детально было проделано с 4 pMON конструкциями, 10539 (только 185), 10537 (только 240), 10540 (185 и 240) и 10705 (только 462). Результаты указывают на то, что присутствие 240 замен обеспечивало создание существенного количества растений, токсичных для насекомых (pMON 10540; 23 из 88, pMON 10537; 17 из 57). Отсутствие 240 замен приводило к низкой частоте встречаемости токсичных для насекомых растений с низкими уровнями B.t.k. белка. При этом результаты совпадали с результатами исследования гена дикого типа. Эти результаты указывают, что замены в 240 районе ответственны за существенное увеличение уровня экспрессии B.t.k., который был выше, чем в аналогичной конструкции с геном дикого типа в табаке. Замены в дополнительных районах (185, 462, 669), принадлежащие к 240, приводят к увеличению уровня экспрессии B.t.k. (>2 раз). Однако замены в районе 240 N-терминальной части гена все же приводят к значительному увеличению уровня экспрессии.
Несмотря на важность изменения района 240 для экспрессии модифицированных генов, возросшая экспрессия может достигаться и изменением других районов. Были получены гибридные гены, частично состоящие из генов дикого типа, частично из синтетических генов, для того, чтобы определить влияние сегментов синтетического гена на уровни экспрессии B.t.k. Гибридный ген создавали из N-терминальной трети (нуклеотиды с 1 по 590 на фиг.2 - 4 до Xbal сайта) и C-терминального конца B. t.k. HD-1 гена (pMOM 5378) дикого типа. Растения, трансформированные этим вектором, были также токсичны для насекомых, как и растения, трансформированные модифицированным HD-1 геном (pMON 5370). Это обусловлено изменением района 240. pMON 10538, содержащую гибридный ген c N-терминальной третью (ген дикого типа первые 600 пар нуклеотидов до второго Xbal сайта) и синтетическими C-терминальными последними двумя третями (пары нуклеотидов с 590 до 1845 на фиг.5 - 7), использовали для трансформации табака и получали значительное увеличение уровня экспрессии. Уровни экспрессии были такими же высокими, как наблюдаемые с синтетическим геном, но сравнимы с уровнями экспрессии модифицированного гена. Эти результаты показывают, что модификация района 240 несущественна для обеспечения увеличенной экспрессии, так как pMON 10538 имеет интактный 240 район. Полностью синтетический ген в большинстве случаев обеспечивает превосходящие уровни экспрессии B.t.k. (см. пример 2).
Пример 2. Полностью синтетический B.t.k. HD-1 ген.
Синтетический B.t.k. HD-1 ген получен с использованием кодонов, которые предпочтительно используются растениями (см. табл.5). В табл.5 перечислены кодоны и частота их встречаемости в генах двудольных растений по сравнению с частотой их встречаемости в B.t.k. HD-1 гене дикого типа (аминокислоты I-615) и синтетическом гене этого примера. Общее количество аминокислоты в этом сегменте указано в скобках под обозначением аминокислоты.
У конечного синтетического гена отсутствуют последовательности АТТТА, и он содержит только один потенциальный сайт полиаденилирования и имеет Г + Ц состав, равный 48,5%. На фиг.5 - 7 приведено сравнение последовательности HD-1 дикого типа с последовательностью синтетического гена для аминокислот 1-615. Наблюдается приблизительно 77% гомологии ДНК между синтетическим геном и геном дикого типа и заменены 366 из 615 кодонов (приблизительно 60%).
Пример 3. Синтетический B.t.k. HD-73 ген.
Кристаллический белковый токсин B. t. k. HD-73 обладает более высокой активностью против некоторых сельскохозяйственно важных вредителей. Белковые токсины HD-1 и HD-73 имеют гомологию (приблизительно 90%) в N-терминальных 450 аминокислотах, но значительно отличаются в районе аминокислот 451-615. Слитые белки, включающие аминокислоты 1-450 HD-1 и 451-615 HD-73, обладают инсектицидными свойствами HD-73 дикого типа. Стратегия создания гибридного гена была такова: использовали 5'-концевые две трети синтетического HD-1 гена (первые 1350 нуклеотидов, до Sacl сайта) и сильно модифицировали последние 590 оснований (через 645 аминокислоту) HD-73 в соответствии с алгоритмом, использованным для планирования синтетического HD-1 гена. В табл.6 внизу перечислены олигонуклеотиды, использованные для модификации HD-73 гена, в порядке использования в гене от 5' к 3' концу. Девять олигонуклеотидов применяли в 590 нуклеотидном районе, каждый нуклеотид протяженностью от 33 до 60 оснований. Только районы слева содержали области, в которых не было длинных непрерывных участков A или T нуклеотидов (длиннее шести). Все сайты полиаденилирования и сайты ATTTA были элиминированы.
Результирующий ген имеет два потенциальных сайта полиаденилирования (по сравнению с 18 в гене дикого типа) и не имеет ATTTA последовательности (12 в гене дикого типа). Г+Ц состав увеличился с 37 до 48%. Все 59 индивидуальных замен пар оснований были сделаны, используя праймеры из табл. 6. В целом, имеется 90% гомология ДНК между районом гена HD-73, модифицированного сайт-специфическим мутагенезом, и последовательностью дикого типа аналогичного района HD-73. Был получен синтетический HD-73 - гибрид первых 1360 нуклеотидов из синтетического HD-1 и следующих 590 нуклеотидов или около того модифицированной HD-73 последовательности. Фиг. 8-10 - сравнение вышеописанного синтетического B.t.k. HD-73 и B.t.k. HD-73 гена дикого типа, кодирующего аминокислоты 1-645. В модифицированном районе HD-73 гена 44 из 170 кодонов (25%) было заменено в результате сайт-специфического мутагенеза с помощью олигонуклеотидов, находящихся в табл. 6. В целом, приблизительно 50% кодонов в синтетическом B.t.k. HD-73 отличаются от аналогичного гена дикого типа и гена HD-73.
В синтетическом HD-73 гене в процессе секвенирования 3' конца в нуклеотидной паре 1890 обнаружили делецию. Это приводит к мутации типа сдвига рамки считывания, начиная с аминокислоты 625, с образованием преждевременного стоп-кодона в аминокислоте 640, (pMON 5379). В табл. 7 приведены сравнение встречаемости кодонов гена B.t.k. HD-73 дикого типа и синтетического гена по аминокислотам 451-645, а также сведения о предпочтительном использовании кодонов в природных генах двудольных растений. Общее количество встречаемости каждой аминокислоты в этом сегменте синтетического гена находится в скобках под обозначением аминокислоты.
Конструировали еще один усеченный синтетический HD-73 ген. Последовательность этого синтетического HD-73 гена идентична последовательности вышеописанного синтетического HD-73 гена в районе, в котором они перекрываются (аминокислоты 29-615), и она кодирует Met-Ala на N-конце. На фиг. 14-16 представлено сравнение этого усеченного синтетического HD-73 гена с N-терминальным Met-Ala фрагментом HD-73 гена дикого типа.
В то время как предыдущие примеры были направлены на получение синтетических и модифицированных генов, кодирующих усеченные B.t.k. белки, могут также быть получены синтетические и модифицированные гены, кодирующие полноразмерные токсичные белки.
Один полноразмерный B.t.k. ген был получен из синтетической последовательности HD-73 (см. фиг. 8-10, нуклеотиды 1-1845 плюс HD-73 последовательность дикого типа, кодирующая 616 аминокислот C-концевого нативного белка). На фиг. 17-21 приведено сравнение синтетического гена, слитого с полноразмерным HD-73 геном дикого типа и полноразмерным HD-73 геном дикого типа.
Еще один полноразмерный B. t.k. ген, состоящий из синтетической HD-73 последовательности, приведен на фиг. 8-10 (нуклеотиды 1-1845 плюс модифицированная HD-73 последовательность, кодирующая 616 аминокислот C-концевого нативного белка). C-концевой район был модифицирован с помощью сайт-специфического мутагенеза, чтобы удалить имеющиеся сигналы полиаденилирования и ATTTA последовательности в соответствии с алгоритмом фиг. 1. На фиг. 22-26 приведено сравнение этого синтетического модифицированного полноразмерного HD-73 гена с полноразмерным HD-73 геном дикого типа.
Еще один полноразмерный B.t.k. ген, состоящий из полной синтетической последовательности HD-73, которая объединяет синтетическую HD-73 последовательность (нуклеотиды 1-1845 плюс синтетическая последовательность, кодирующая 616 аминокислот C-концевого нативного белка), представлен на фиг. 8-10. C-концевая синтетическая часть предназначена для снижения числа сигналов полиаденилирования и последовательностей ATTTA и для включения предпочтительно используемых в растении кодонов. На фиг. 27-31 дано сравнение этого полностью синтетического полноразмерного HD-73 гена с полноразмерным HD-73 геном дикого типа.
Альтернативно, еще один полноразмерный B.t.k. ген, состоящий из полностью синтетической последовательности, включающей 1-1830 пар нуклеотидов B.t. k. HD-73, представлен на фиг. 5-7 и 1834-3534 B.t.k. HD-73 ген представлен на фиг. 27-31.
Пример 4. Экспрессия модифицированного и синтетического B.t.k. HD-1 генов и синтетического HD-73 гена.
Сконструирован целый ряд векторов для трансформации растений с целью экспрессии B.t.k. генов путем объединения структурных кодирующих последовательностей ранее описанных генов в кассете экспрессии pMON 893 для трансформации растений. Соответствующий вектор трансформации встраивали в подходящий "разоруженный" вектор для Agrobacrerium, такой как A.tumefaciens ACO, supra. Растительные эксплантаты культивировали вместе с "разоруженным" вектором для Agrobacrerium, и растения регенерировали в результате селекции на канамициновую устойчивость, используя известные методы: табак (Horsch R.B. et al. , Science, 1985, 227:1229), томаты (McCormick S. et al., Plant Cell Reports, 1986, 5: 81-84) и хлопок (Trolinder N.L. and Goodin J.R., Plant Cell Reports, 1987, 6: 231-234).
а) Табак.
Уровень экспрессии B. t. k. HD-1 белка в трансгенных растениях табака, содержащих pMON 9921 (усеченный, дикого типа), pMON 5370 (модифицированный HD-1, пример 1, фиг. 2-4) и pMON 5377 (синтетический HD-1, пример 2, фиг. 5-7), анализировали с помощью Вестерн-анализа. Ткань листьев замораживали в жидком азоте, растирали до тонкого порошка и затем растирали в 12 (вес/объем) ДДС-ПЭГ буфера для получения образца. Образцы замораживали на сухом льду, затем инкубировали 10 мин в кипящей водяной бане и микроцентрифугировали в течение 10 мин. Концентрацию белка в супернатанте определяли методом Брэдфорда (Anal. Biochem. 72: 248-254). 50 мкг белка наносили на дорожку 9% ДДС-ПЭГ геля, белок переносили на нитроцеллюлозу и B.t.k. HD-1 белок визуализировали, используя антитела, продуцируемые против B.t.k. HD-1 белка, как первичные антитела и вторичные антитела против конъюгированной щелочной фосфатазы, как описано изготовителем (Promega, Madison, WI). Очищенный трипсиновый HD-1 фрагмент использовали как контроль. Принимая во внимание, что B. t. k. белок из растений табака, содержащих pMON 9921, был ниже уровня детекции, B.t.k. белок из растений, содержащих модифицированный (pMON 5370) и синтетический (pMON 5377) гены, легко детектировался. B.t.k. белок из растений, содержащих pMON 9921, оставался недетектируемым даже при 10-кратном времени инкубации. Соответствующие уровни B.t.k. HD-1 белка в этих растениях приведены в табл. 8. Так как белок в растениях, содержащих pMON 9921, не наблюдали, уровень белка в этих растениях оценивали по соответствующему уровню мРНК (см. ниже). Растения, содержащие модифицированный ген (pMON 5370), экспрессировали приблизительно в 100 раз больше B.t.k. белка, чем растения, содержащие ген дикого типа (pMON 9921). Растения, содержащие полностью синтетический B.t.k. HD-1 ген (pMON 5377), экспрессировали приблизительно в пять раз больше белка, чем растения, содержащие модифицированный ген. Модифицированный ген способствует большему увеличению экспрессии B. t.k. белка. Растения, использованные для получения этих данных, содержат лучшие представители каждой конструкции. При этом анализ осуществляли или на табачной бабочке-бражнике, либо на данных, полученных с помощью Вестерн-анализа.
Растения, содержащие эти гены, тестировались на биоактивность, чтобы определить, приводят ли повышенные количества белка, наблюдаемого в Вестерн-анализе, к соответствующему увеличению биоактивности. Листья растений, использованных для Вестерн-анализа в табл. 2, тестировали на биоактивность против двух насекомых. Детальный анализ листьев был сначала проделан с использованием табачной бабочки-бражника, исключительно чувствительного насекомого. Листья из всех трех трансгенных растений табака полностью были защищены и вызывали 100% смертность табачной бабочки-бражника (см. табл. 9).
В другом детальном биоанализе использовали насекомое, гораздо менее чувствительное (червь листовой хлопковый). Совка-карадрина приблизительно в 500 раз менее чувствительна к B.t.k. HD-1 белку, чем табачная бабочка-бражник. Разница в чувствительности этих двух насекомых была определена с использованием очищенного HD-1 белка в анализе пищевого режима (см. ниже). Растения, содержащие ген дикого типа (pMON 9921), демонстрировали только минимальную защиту от совки-карадрина, тогда как растения, содержащие модифицированный ген, показывали почти полную защиту, а растения, содержащие полностью синтетический ген, были целиком защищены от повреждения совкой-карадрина. Результаты этих биоанализов подтверждают уровни экспрессии B.t.k. HD-1, наблюдаемые при Вестерн-анализе, и демонстрируют, что повышенные уровни B.t.k. HD-1 белка коррелируют с повышенной инсектицидной активностью.
Биоактивность B.t.k. HD-1 белка, продуцируемого этими трансгенными растениями, далее исследовали для более точной количественной оценки относительных активностей. Листовую ткань из растений табака, содержащую гены дикого типа, модифицированные и синтетические, растирали в 100 мМ буфере карбоната натрия, pH 10 в соответствии 1:2 (вес:объем). Отделяющийся материал удаляли центрифугированием. Супернатант объединяли в синтетическую диету подобно тому, как описано Marrone и соавт. (Marrone et al., J. Econ. Entomol., 1985, 78: 290-293). Диетический субстрат готовили в день теста с растворами растительного экстракта вместо 20% водного компонента. Один мл диетической среды по аликвоте разливали в 96-гнездные микротитровальные планшеты. После высушивания "диеты" в каждую лунку добавляли по одной личинке однодневного табачного почкового червя. Для каждого растительного образца тестировали 16 насекомых. Растения инкубировали при 27oC. Через 7 дн обработанные личинки объединяли и взвешивали на аналитических весах. Средний вес на насекомого подсчитывали и сравнивали со стандартным графиком, характеризующим концентрации B. t. k. белка к среднему весу личинки. Вес насекомых был обратно пропорционален (в логарифмической шкале) относительному увеличению концентрации B.t.k. белка. Количество B.t.k. HD-1 белка, вызывающее увеличение ингибирования роста личинок, определяли для двух разных растений, содержащих по 3 гена. Специфическую активность (нг B.t.k. HD-1 белка на мг растительного белка) определяли для каждого растения. Растения, содержащие модифицированный HD-1 ген (pMON 5370), содержали в среднем приблизительно 1400 нг (1200 и 1600 нг) B.t.k. HD-1 белка на мг экстрагированного белка растений. Эта величина сравнима с 1000 нг B.t.k. HD-1 белка на мг экстрагированного белка растений, как определено Вестерн-анализом (табл. 2). Концентрации B.t. k. HD-1 белка для растений, содержащих синтетический HD-1 ген, составляли в среднем приблизительно 8200 нг (7200 и 9200 нг) B.t.k. HD-1 белка на мг экстрагированного белка растений. Это число сравнимо с 5000 нг HD-1 белка на мг экстрагированного белка растений, оцененного с помощью Вестерн-анализа. Подобно этому растения, содержащие синтетический ген, обладали приблизительно в 6 раз большей специфической активностью, чем соответствующие растения, содержащие модифицированный ген. В Вестерн-анализе это соотношение приблизительно равно 10, что вполне соответствует данным, полученным с помощью биоанализа. Уровень B.t.k. белка в растениях, содержащих ген HD-1 дикого типа (pMON 9921), был очень низким, чтобы вызвать значительное уменьшение веса личинок и, следовательно, был ниже уровня, который мог бы быть подсчитан в этом анализе. Уровни B.t.k. HD-1 белка, определенные с помощью биоанализа и Вестерн-анализа, для растений, содержащих модифицированные и синтетические гены, согласуются, что демонстрирует, что B.t.k. HD-1 белок, продуцируемый этими растениями, является биологически активным.
Уровни мРНК определяли в растениях, содержащих B.t.k. HD-1 ген (pMON 9921) дикого типа и модифицированный ген (pMON 5370), для выяснения того, чем вызваны повышенные уровни белковой продукции - увеличением транскрипции или трансляции. мРНК из растений, содержащих синтетический ген, не может анализироваться той же пробой ДНК, которую использовали для генов дикого типа, модифицированных в результате многочисленных замен, в кодирующей последовательности. мРНК выделяли и гибридизировали с одноцепочечной пробой ДНК, гомологичной приблизительно 90 пн 5' кодирующей последовательности гена дикого типа или модифицированного гена. Гибриды обрабатывали SI нуклеазой, и связанные с пробой фрагменты анализировали электрофорезом в геле. Так как использовались большой избыток пробы и длительное время гибридизации, количество связанной пробы пропорционально количеству мРНК B.t.k., присутствующей в этом образце. Два растения, экспрессирующие модифицированный ген (pMON 5370), как было обнаружено, продуцируют в 10 раз больше РНК, чем растение, экспрессирующее ген дикого типа (pMON 9921).
Повышенный уровень мРНК модифицированного гена согласуется с результатом, который предполагалось получить в результате модификаций, введенных в этот ген. Однако это 10-кратное увеличение мРНК модифицированного гена по сравнению с геном дикого типа контактирует с 100-кратным увеличением B.t.k. белка в результате экспрессии этих генов в растениях табака. В случае, если две мРНК одинаково хорошо транслировались, можно было бы ожидать 10-кратное увеличение стабильной мРНК, что дало бы 10-кратное увеличение белка.
Более высокое увеличение уровня белка указывает на то, что мРНК модифицированного гена транслируется с большей эффективностью (в 10 раз), чем мРНК дикого типа. Таким образом, около половины общего эффекта экспрессии гена объясняется изменениями в уровнях мРНК, другая половина - изменениями эффективности трансляции. Это увеличение эффективности трансляции поражает тем, что только около 9,5% кодонов было заменено в модифицированном гене, то есть понятно, что этот эффект не обусловлен полной сменой предпочтительно используемых кодонов. Повышенная эффективность трансляции, по-видимому, обусловлена изменением во вторичной структуре мРНК, которое действует на трансляцию, или удалением специфических трансляционных блоков, обусловленных специфическими кодонами, которые были изменены.
Увеличенная экспрессия, продемонстрированная с синтетическим HD-1 геном, была также продемонстрирована с синтетическим HD-73 геном в табаке. B.t.k. HD-73 белок детектировали в экстрактах растений табака, содержащих усеченный ген HD-73 дикого типа (pMON 5367). B.t.k. HD-73 белок также обнаруживали в экстрактах из растений табака, содержащих синтетический HD-73 ген (фиг. 8-10) (pMON 5383). Приблизительно 1000 нг B.t.k. HD-73 белка было обнаружено на мг общего растворимого белка растений.
Как описано выше в примере 3, B.t.k. HD-73 белок, кодируемый pMON 5383, содержит небольшой C-концевой избыток аминокислот, которые отсутствуют в HD-73 белке дикого типа. Эти экстрааминокислоты не оказывали влияния на токсичность белка и на экспрессию в растении. Второй синтетический HD-73 ген конструктировали, как описано в примере 3 (фиг. 14-16), и использовали для трансформации табака (pMON 5390). Анализ растений, содержащих pMON 5390, показал, что этот ген экспрессировался на уровнях, сравнимых с уровнями pMON 5383, и что эти растения имели сходную инсектицидную эффективность.
В растениях табака синтетический HD-1 ген экспрессировался приблизительно на 5-кратном уровне по сравнению с синтетическим HD-73 геном. Однако этот синтетический HD-73 ген экспрессировался по меньшей мере в 100 раз лучше, чем HD-73 ген дикого типа. HD-73 белок приблизительно в 5 раз более токсичен для многих насекомых-вредителей, чем HD-1 белок. Таким образом, как HD-1, так и HD-73 гены обеспечивают приблизительно сравнимую инсектицидную эффективность в табаке.
Полноразмерные B. t. k. HD-73 гены, описанные в примере 3, были также вставлены в вектор для трансформации растений pMON 893 так, чтобы они экспрессировались с En 35S промотора. Синтетический дикого типа полноразмерный HD-73 ген (фиг. 17-21) вставляли в pMON 893 для создания pMON 10505. Синтетический модифицированный полноразмерный HD-73 ген (фиг. 22-26) вставляли в pMON 893 для создания pMON 10526. Полностью синтетический HD-73 ген (фиг. 27-31) объединяли с pMON 893 для создания pMON 10518. Эти векторы использовали для получения трансформированных растений табака, и эти растения анализировали на инсектицидную эффективность и на содержание B.t.k. HD-73 белка Вестерн-блотами или иммуноанализом ELISA.
Растения табака, содержащие все три полноразмерных B.t.k. гена, продуцировали детектируемый B.t.k. белок и вызывали 100% смертность табачной бабочки-бражника. Этот результат является неожиданным в свете ранее сообщенных попыток экспрессировать полноразмерные B.t.k. гены в трансгенных растениях. Vaeck et al. (1987) сообщили, что полноразмерный B.t.k. berliner ген, подобный нашему HD-1 гену, не экспрессировался на детектируемом уровне в табаке. Barton et al. (1987) описали подобный результат для еще одного полноразмерного гена из B.t.k. HD-1 (так называемый 4,5 тпн ген) и в дальнейшем указывали, что каллюс табака, содержащий этот ген, становится некротическим, таким образом указывая, что продукт полноразмерного гена токсичен для растительных клеток. Rischhoff et al. (1987) описали, что полноразмерный B.t.k. HD-1 ген слабо экспрессировался в томатах по сравнению с усеченным геном, и не было растений, которые были полностью токсичными для табачной бабочки-бражника. Все три вышеперечисленных сообщения указывают, что гораздо более высокие уровни экспрессии и появление токсичных растений были выявлены, если соответствующие B. t.k. гены были усеченными. Adang et al. (1987) сообщили, что полноразмерный HD-73 ген давал несколько растений табака с некоторой биологической активностью (ни одно не было высоко токсичным) против бабочки-бражника и плохо детектируемый B.t.k. белок. Ими также было замечено, что основная B.t.k. мРНК в этих растениях была усеченная 1,7 тпн, т.е. не могла кодировать функциональный токсин. Все это указывало на неправильную экспрессию гена в табаке. В противоположность всем этим сообщениям три полноразмерных B. t.k. HD-73 гена, описанных выше, обеспечивают относительно высокие уровни белка и высокие уровни токсичности для насекомых.
Содержание B.t.k. белка и уровни мРНК в растениях табака показаны в табл. 10 для трех векторов. Как можно видеть из этой таблицы, синтетический ген дикого типа (pMON 10506) продуцирует приблизительно 0,01% B.t.k. белка от общего растворимого белка, синтетический модифицированный ген продуцирует около 0,02% B.t.k. белка от общего растворимого белка и полный синтетический ген продуцирует около 0,2% B.t.k. белка от общего растворимого белка. мРНК B.t.k. в этих растениях анализировали с помощью Норзерн-блот-анализа, используя общий 5' синтетический конец этих генов в качестве пробы. Как показано в табл. 10, повышенные уровни белка могут в значительной степени объясняться повышенными уровнями мРНК. По сравнению с усеченным модифицированным и синтетическим генами это может указывать, что главный вклад в повышенную эффективность трансляции вносит 5' часть гена, в то время как 3' часть гена содержит главным образом детерминанты стабильности мРНК. Повышенные уровни белка также подтверждают, что увеличенное количество полноразмерного гена, который является синтетическим или модифицированным, увеличивает B.t.k. уровни белка. По сравнению с усеченными синтетическими B.t.k. HD-73 генами (pMON 5383 или pMON 5390) полностью синтетический ген (pMON 10518) продуцирует гораздо или слегка больше B.t.k. белка, демонстрируя, что полноразмерные гены способны экспрессироваться на высоких уровнях в растениях. Эти растения табака с высоким количеством полноразмерного HD-73 белка не являются аномальными и полностью воспроизводимы. Содержание B.t.k. белка в этих растениях также дает ожидаемые уровни токсичности для насекомых при пищевом исследовании с червем листовым хлопковым или анализах пищевого режима растительных экстрактов с табачным почковым червем. B.t.k. белок, выявленный Вестерн-блот-анализом, в этих растениях табака часто содержит различное количество белка (около 80 кДа), который, по-видимому, является протеолитическим фрагментом полноразмерного белка. C-терминальная половина полноразмерного белка, как известно, чувствительна к протеолизу, и подобные протеолитические фрагменты видны в случае полноразмерного гена E.coli и B.t.k. Эти фрагменты обладают инсектицидной активностью. Норзерн-блот-анализ показал, что все мРНК этих полноразмерных генов имели полную длину. При этом не были обнаружены усеченные мРНК, которые давали начало 80 кДа белковому фрагменту. В дополнение, возможно, что этот фрагмент не присутствует в интактных растительных клетках и обусловлен протеолизом во время экстракции для иммуноанализа.
Таким образом, отсутствует серьезное препятствие для получения высоких уровней B.t.k. HD-73 белка в растениях с синтетическим геном. Это, по-видимому, справедливо и для других полноразмерных лепидоптерноактивных генов, таких как B. t.k. HD-1 или B.t.entomocidus. Полностью синтетический B.t.k. HD-1 ген из примера 3 встраивался в векторы для трансформации растений, такие как pMON 893.
Полностью синтетический ген использовали в еще одном растительном векторе в pMON 10518 и анализировали в растениях табака. Хотя CaMV 35S промотор является в основном конструктивным промотором с высоким уровнем экспрессии генов в большинстве растительных тканей, уровень экспрессии под контролем CaMV 35S ниже в цветочной ткани по отношению к уровням, наблюдаемым в тканях листьев. Так как экономически важные части цветка и происходящие из цветка части служат мишенями, которые повреждаются некоторыми насекомыми (например, хлопковые коробочки и шелуха, бутоны табака, бутоны и плоды томатов), необходимо увеличение экспрессии B.t.k. белка в этих тканях по сравнению с тем, который получен с помощью CaMV 35S промотора.
35S промотор вируса мозаики остроконечной кондиломы (FMV) аналогичен CaMV 35S промотору. Этот промотор был выделен и встроен в вектор для трансформации растений, аналогичный pMON 893. По сравнению с CaMV промотором FMV 35S промотор высоко экспрессируется в цветочной ткани, одновременно обеспечивая высокие уровни экспрессии гена в других тканях, таких как ткань листа. Был сконструирован вектор трансформации растений pMON 10517, в котором полноразмерный синтетический B.t.k. HD-73 ген с фиг. 27-31 находился под контролем FMV 35S промотора. Этот вектор идентичен pMON 10518 примера 3, за исключением того, что FMV промотор заменен на CaMV промотор. Были получены растения табака, трансформированные pMON 10517 и pMON 10518, и они сравнивались на экспрессию B.t.k. белка с помощью Вестерн-блот или ELISA иммуноанализа в листьях и цветочной ткани. Этот анализ показал, что pMON 10517, содержащий FMV промотор, экспрессирует на более высоком уровне полноразмерный HD-73 белок в цветочной ткани, чем pMON 10518, содержащий CaMV промотор. Экспрессия полноразмерного B. t. k. HD-73 белка из pMON 10517 в ткани листа сравнима с экспрессией, наблюдаемой в растениях, содержащих pMON 10518. Однако при анализе цветочной ткани выявили, что растения табака, содержащие pMON 10518, имели высокое содержание B.t.k. белка в ткани листа, но при этом B.t.k. белок в цветках не был выявлен. С другой стороны, цветки растений табака, содержащих pMON 10517, имели высокое содержание B.t.k. белка, почти такое же, как содержание этого белка в листьях (приблизительно 0,05% от общего растворимого белка). Этот анализ показал, что FMV промотор может быть использован для получения относительно высокого содержания B.t.k. белка в цветочной ткани по сравнению с CaMV промотором.
б) Томаты.
B.t.k. HD-1 гены дикого типа, модифицированный и синтетический, тестированные в табаке, вводили в другие растения, чтобы продемонстрировать широкие возможности этого изобретения. Получали трансгенные томаты, содержащие три этих гена. Полученные данные показывают, что повышенная экспрессия, наблюдаемая с модифицированным и синтетическим генами, также наблюдается в случае использования томатов. Принимая во внимание, что B.t.k. HD-1 белок очень слабо выявляется в растениях, содержащих HD-1 дикого типа (pMON 9921), B.t. k. HD-1 белок легко обнаружили и определили его содержание для растений с модифицированным (pMON 5370) или синтетическим (pMON 5377) геном. Уровни экспрессии для растений, равнялись приблизительно 10, 100 и 500 нг на мг общего растительного экстракта (см. табл. 11). Увеличение содержания B.t.k. HD-1 белка при использовании модифицированного гена обеспечивало большую часть наблюдаемого увеличения, в 10 раз выше, по сравнению с растениями, содержащими ген дикого типа, и в 5 раз выше в случае растений, содержащих синтетический ген. Замены, введенные в модифицированный ген с помощью сайт-специфического мутагенеза, обеспечивают повышенную экспрессию B.t.k. HD-1 белка.
Отличия в экспрессии B.t.k. HD-1 белка были подтверждены биоанализом с использованием табачной бабочки-бражника и совки-карадрина. Учитывали листья томатов, содержащих эти гены, вызывающие гибель табачной бабочки-бражника и ее 100% смертность. В случае совки-карадрина листья, содержащие HD-1 ген дикого типа (pMON 9921), имели значительные повреждения, листья растений, содержащих модифицированный ген (pMON 5370), были повреждены меньше, а листья растений, содержащих синтетический ген (pMON 5377), были полностью защищены (см. табл. 12).
В томатах, экстрактах из растений, содержащих усеченный HD-73 ген дикого типа (pMON 5367), не детектировался HD-73 белок. Экстракты из растений, содержащих синтетический HD-73 ген (pMON 5383), демонстрировали высокие уровни B. t. k. HD-73 белка, приблизительно 2000 нг на мг экстракта растительных белков. Эти данные подтверждают, что замены, сделанные в синтетическом HD-73 гене, ведут к значительному увеличению экспрессии HD-73 белка в томатах так же, как и табаке.
В отличие от табака синтетический HD-73 ген в томатах экспрессируется приблизительно на 4-5 раз более эффективно, чем синтетический HD-1 ген. Так как HD-73 белок является приблизительно в 5 раз более активным, чем HD-1 белок, против целого ряда насекомых-вредителей, включая виды Heliothis, увеличенная экспрессия синтетического HD-73 по сравнению с HD-1 соответствует приблизительно 25-кратному увеличению инсектицидной активности в томатах.
Для того, чтобы определить механизмы, вовлеченные в повышенную экспрессию модифицированного и синтетического B.t.k. HD-1 генов в томатах, осуществили SI нуклеазный анализ содержания мРНК в трансформированных растениях томатов. Как указано выше, подобный анализ был выполнен с растениями табака, и этот анализ показал, что модифицированный ген продуцирует до 10 раз больше мРНК, чем ген дикого типа. При анализе в томатах использовали другую пробу ДНК, которая позволяла анализировать HD-1 гены дикого типа (pMON 9921), модифицированный (pMON 5370) и синтетический (pMON 5377). Эту пробу получали из 5' нетранслируемого района промотора CaMV 35S в pMON 893, который был общим у всех этих трех векторов (pMON 9921, pMON 5370 и pMON 5377). SI-анализ показал, что содержание мРНК B.t.k. модифицированного гена было от 3 до 5 раз выше, чем в случае гена дикого типа, и что содержание мРНК синтетического гена было в 2-3 раза выше, чем в случае модифицированного гена. Три независимых трансформанта анализировались для каждого гена. По сравнению с увеличением B. t. k. HD-1 белка в томатах (см. табл. 11) эти увеличения количества мРНК могут объяснить приблизительно половину увеличения общего содержания белка, как было показано для табака в случае генов дикого типа и модифицированного гена. Для томатов общее увеличение мРНК гена дикого типа по сравнению с мРНК синтетического гена равно приблизительно от 6 до 15, в то время как увеличение содержания белка составляет около 50 раз. Этот результат подобен наблюдаемому для табака при сравнении гена дикого типа и модифицированного гена, а также распространяется на синтетический ген. То есть, около половины общего увеличения содержания B.t.k. белка в случае гена дикого типа и модифицированного гена объясняется увеличением содержания мРНК и около половины - увеличенной эффективностью трансляции. Это верно также при сравнении модифицированного гена с синтетическим. Хотя наблюдается увеличение содержания мРНК, однако это увеличение содержания мРНК может объяснить только около половины увеличения общего количества белка.
Описанные выше полноразмерные B.t.k. гены использовали для трансформации растений табака. Эти растения анализировали на наличие B.t.k. белка и инсектицидную активность. Результаты этого анализа приведены в табл. 13. Растения, содержащие ген синтетический дикого типа (pMON 10506), продуцируют B.t. k. HD-73 белок на уровнях около 0,01% от уровня общего растворимого белка. Растения, содержащие ген синтетический модифицированный (pMON 10526), давали около 0,04% B.t.k. белка, и растения, содержащие полностью синтетический ген (pMON 10518), продуцировали около 0,2% B.t.k. белка. Эти результаты совпадают с результатами на растениях табака для тех же генов. Содержание мРНК, оцененное Норзерн-блот-анализом в томатах, также увеличивается параллельно с увеличением белкового уровня. Как в случае с табаком и этими тремя генами, большая часть увеличения содержания белка может быть объяснена увеличением мРНК и небольшой долей увеличения эффективности трансляции для полностью синтетического гена. Наибольшие уровни содержания полноразмерного B.t.k. белка (pMON 10518) сравнимы или слегка ниже, чем наибольшие уровни, наблюдаемые в случае усеченных HD-73 генов (pMON 5383 и pMON 5390). Растения томатов, экспрессирующие эти полноразмерные гены, имеют инсектицидную активность, соответствующую наблюдаемому уровню белка, что было установлено пищевым анализом с листовым хлопковым червем или введением в диету растительных экстрактов в случае с табачной бабочкой-бражником.
в) Хлопок.
Большая экспрессия B. t.k. HD-1 и B.t.k. HD-73 при использовании модифицированного и синтетического генов была выявлена и на хлопке. Получили трансгенный каллюс, который содержал HD-1 гены дикого типа (pMON 9921) и синтетический ген (pMON 5377). B.t.k. HD-1 белок, продуцируемый каллюсом, содержащим ген дикого типа, не был обнаружен, тогда как каллюс, содержащий синтетический HD-1 ген, экспрессировал HD-1 белок, который легко выявлялся. В экстракте из каллюса продуцируется приблизительно 1000 нг/мг HD-1 белка. Для того, чтобы убедиться, что белок, продуцируемый каллюсом трансгенного хлопка, биологически активен и что повышенная экспрессия, наблюдаемая с транслируемого гена, обеспечивает увеличение биологической активности, экстракты каллюса хлопка готовили тем же способом, что и описанным для растений табака, за исключением того, что каллюс сначала высушивали между листами Ватман для удаления всей возможной воды. Высушенный каллюс растирали в жидком азоте, а затем растирали в 100 мМ буфера карбоната натрия, pH 10. Приблизительно 0,5 мл аликвоты этого материала помещали на листья томатов красильной кистью. После высушивания листьев 5 личинок бабочки-бражника сажались на каждый из двух образцов листьев. Листья, "окрашенные" экстрактом из контрольного каллюса, были полностью повреждены. Листья, "окрашенные" экстрактом из каллюса, содержащего HD-1 ген дикого типа (pMON 9921), были сильно повреждены. Листья, "окрашенные" экстрактом из каллюса, содержащего HD-1 синтетический ген (pMON 5377), не имели повреждений (см. табл. 14).
Получали каллюс хлопка, содержащий еще один синтетический ген, ген, кодирующий B. t. k. HD-73 белок. Получение этого гена описано в примере 3. Каллюс, содержащий синтетический HD-73 ген, продуцировал соответствующий HD-73 белок на более высоких уровнях, чем каллюс, который содержал синтетический HD-1 ген. Экстракты, сделанные из каллюса, содержащего HD-73 синтетический ген (pMON 5383), обеспечивали большую защиту от табачной бабочки-бражника, когда их наносили на листья томатов, что соответствовало тому, что описано для экстрактов, содержащих HD-1 белок (см. табл. 14).
Были исследованы трансгенные растения хлопка, содержащие синтетический B. t. k. HD-1 ген (pMON 5377) и синтетический B.t.k. HD-73 ген (pMON 5383). Эти растения продуцируют HD-1 или HD-73 белки на уровнях, сравнимых с уровнями, наблюдаемыми в каллюсе хлопка с теми же генами, эти уровни сравнимы с уровнями, наблюдаемыми в каллюсе хлопка при использовании тех же генов и сравнимы с уровнем экспрессии в томатах и растениях табака, содержащих эти гены. Были выявлены растения хлопка, экспрессирующие B.t.k. белок от 1000 до 2000 нг/мг общего белка (от 0,1 до 0,2%), при использовании усеченного синтетического HD-1 гена или HD-73 гена. С листьями растений табака с синтетическим HD-1 или HD-73 геном были проведены пищевые анализы насекомых. Эти листья не повреждались (оценка 0) при использовании личинки капустного лупера (Trichoplusia ni) и имели легкие повреждения личинками совки-карадрина (Spodoptera exiqua). Оценку вреда проводили, как приведено в табл. 8. Было продемонстрировано, что растения хлопка так же, как каллюс, экспрессируют синтетические HD-1 или HD-73 гены на высоких уровнях и что эти растения защищены от повреждения личинками насекомых Lepidoptera. Трансгенные растения хлопка, содержащие усеченный синтетический HD-1 ген (pMON 5377) или усеченный синтетический HD-73 ген (pMON 5383), также были исследованы на их устойчивость к червю семенному хлопковому на всех уровнях развития растений в теплице. Этот тест демонстрировал способность этих растений продуцировать сельскохозяйственно приемлемый уровень белка. Червь семенной хлопковый (Heliothis zea) является основным вредителем хлопка, который вызывает разрушение верхушки, коробочки и семян, и защита этих плодовых тел, так же как листовой ткани, важна для эффективного контроля и адекватной защиты урожая. Для определения степени защиты растения (RI род растений хлопка), экспрессирующие на высоких уровнях B.t.k. HD-1 (pMON 5377) или B.t.k. HD-73 белок (pMON 5383), анализировали, используя 10-15 яиц червя семенного хлопкового на коробочку и приблизительно 20 самых верхних коробочек на каждом растении. Выборка равнялась по меньшей мере 12 растениям на одну обработку. Процент выведенных яиц равнялся приблизительно 70%. Это очень высокий процент насекомых по сравнению с количеством личинок на растение, найденных в случае типичных условий выращивания. В результате 100% коробочек на контрольных растениях хлопка повреждались насекомыми. У трансгенных растений наблюдали значительную защиту коробочек. Растения, содержащие pMON 5377 (HD-1), имели 70-75% "выживших" коробочек в ответ на интенсивное давление в ходе этого анализа. Растения, содержащие pMON 5383 (HD-73), имели 80-90%-ную защиту коробочек. Это, похоже, является следствием высокой активности HD-73 белка против червя семенного хлопкового по сравнению с HD-1 белком. В том случае, когда трансгенные растения повреждались насекомыми, выжившие личинки задерживались в своем развитии по меньшей мере на одно поколение.
Следовательно, повышенная экспрессия, полученная при использовании модифицированных и синтетических генов, не лимитируется одной культурой; табак, томаты и в каллюсе хлопка, и в растениях хлопка наблюдается увеличение экспрессии B. t.k. белка при получении растений/каллюса, содержащих модифицированный или синтетический ген. Подобно этому использование изменений при получении модифицированного или синтетического B.t.k. HD-1 гена не ограничивается HD-1 геном. Синтетический HD-73 ген во всех трех видах растений показывал значительное увеличение экспрессии.
Суммарно продемонстрировано, что
генетические замены, осуществленные в HD-1 модифицированном гене, приводят к очень значительным увеличениям экспрессии B.t.k. HD-1 белка;
получение полностью синтетического гена ведет к дальнейшему пятикратному увеличению экспрессии B.t.k. HD-1 белка;
изменения, объединенные в модифицированном HD-1 гене, объясняют большую часть увеличения экспрессии B.t.k., наблюдаемой при использовании синтетического гена;
повышенная экспрессия продемонстрирована в трех разных растениях - растениях табака, растениях томатов, в каллюсе хлопка и растениях хлопка;
повышенная экспрессия, наблюдаемая с помощью Вестерн-анализа, подтвердила увеличение биоактивности исследуемых белков, показывая, что продуцируемые B.t.k. HD-1 белки являлись сравнительно активными;
способ изобретения использовали для создания синтетического HD-1 гена, для конструирования синтетического HD-73 гена, он также экспрессировался на гораздо более высоких уровнях в табаке, томатах и хлопке по сравнению с эквивалентным геном дикого типа, при этом наблюдали возрастание биоактивности;
полностью синтетический полноразмерный B.t.k. ген экспрессировался на уровнях, сравнимых с усеченными синтетическими генами.
Пример 5. Синтетический ген B.t.tenebrionis в табаке, томатах и картофеле.
Ссылаясь на фиг. 32-34, синтетический ген, кодирующий токсин, активный против Coleopteran, получали введением указанных замен в ген B.t.tenebrionis дикого типа или синтезом de novo синтетического структурного гена. Синтетический ген встраивали во вспомогательный вектор для трансформации растений, такой как pMON 893: плазмиду pMON 893, содержащую синтетический B.t.t. ген, затем вводили в подходящий "разоруженный" штамм Agrobacterium, такой как A. tumefaciens ACO.
Трансформация и регенерация картофеля.
Стерильную культуру побегов Russet Burbank поддерживали в пробирках, содержащих 10 мл среды PM (Murashige и Skoog (MS), неорганические соли, 30 г/л сахарозы, 0,17 г/л NaH2PO4•H2O, 0,4 мг/л тиамин-HCl и 100 мг/л миоинозитола, отвержденного с 1 г/л Gelrite при pH 6. Когда ростки достигали длины приблизительно 5 см, вырезали стеблевые сегменты по 7-10 мм и по срезанным концам заражали "разоруженным" Agrobacterium tumefaciens, содержащим вектор с синтетическим B.t.t. геном (четырехдневная культура). Стеблевые трансплантаты сокультивировали в течение 3 дн при 23oC на стерильной фильтровальной бумаге, помещенной на 1,5 мл питательного слоя для клеток табака, покрывающего 1/10 PM среды (1/10 крепости MS, содержащую неорганические соли и органические добавки без казеина, как у Jarret R.L. et al., Physiol. Plant (1980), 49: 177, 30 г/л сахарозы и 8 г г/л агар). После совместного культивирования эксплантаты переносили на P-1 среду полной концентрации для индукции каллюса, содержащую неорганические соли, органические добавки, за исключением казеина, как у Jarret R.L. и соавт. (1980), 3 мг/л бензиладенина (BA) и 0,01 мг/л нафталинуксусной кислоты (NAA) (Jarret R.L. et al., 1980). Для ингибирования роста бактерий в состав среды включали карбенициллин (500 мг/л), а 100 мг/л канамицина добавляли для отбора трансформированных клеток. Через 4 нед эксплантаты переносили в раствор того же состава, но с 0,3 мг/л гиббереллиновой кислоты (GA3) вместо BA и NAA (Jarret R.L. et al., In Vitro (1981), 17: 825) для стимулирования образования побегов. Ростки начинали развиваться приблизительно через 2 нед после переноса в индуцирующий побеги раствор, их отрезали и переносили в пробирки с PM средой для укоренения. Побеги исследовали на устойчивость к канамицину за счет наличия фермента неомицинфосфотрансферазы II, для этого кусочки стебля помещали на среду, индуцирующую рост каллюса, содержащую органические и неорганические соли, 30 г/л сахарозы, 2,25 мг/л BA, 0,186 мг/л NAA, 10 мг/л GA3 (Webb K.J. et al., Plant Sci. Letters (1983), 30: 1) и 200 мг/л канамицина для отбора трансформированных клеток.
Синтетический B. t. t. ген (см. фиг. 32-34) встраивали в экспрессионный вектор для растений, как описано в примере 5. Эта плазмида имеет следующие характеристики: синтетический BglII фрагмент, имеющий приблизительно 1800 пн, вставляли в pMON 893 таким образом, чтобы усиленный 35S промотор обеспечивал экспрессию B.t.t. гена. Эта конструкция, pMON 1982, использовалась для трансформации как табака, так и томатов. Растения табака, отобранные по устойчивости к канамицину, скринировались с использованием кроличьих анти-B. t. t. антител. Отбирали материал, экспрессирующий белок на таком уровне, который вызывает гибель CPB. Эти насекомые-мишени не кормятся на табаке, однако трансгенные растения табака, содержащие синтетический ген, экспрессируют этот белок на детектируемых уровнях.
Растения томатов, содержащие pMON 1982 конструкцию, продуцировали B.t.t. белок на уровнях, обладающих инсектицидной активностью для CPB. Вначале листья 4 растений (5190, 5225, 5328 и 5133) практически не оказывали воздействия на CPB личинки (вред оценивали по шкале от 0 до 4, при этом эта шкала показывала, что не сохранялись целые листья). При этих условиях контрольные листья были полностью съедены. Иммунологический анализ этих растений подтвердил присутствие материала, перекрестно реагирующего с анти-B.t.t. антителами. Уровни белковой экспрессии в этих растениях оценивали приблизительно от 1 до 5 нг B.t.t. белка в 50 мкг общего экстрагированного белка. Все 17 растений томатов (17 из 65 тестированных) продемонстрировали защиту листовой ткани от повреждения CPB (оценка 0 или 1), и они вызывали хорошую смертность насекомых.
Подобные результаты наблюдались для табака и томатов с pMON 1982, а также были показаны с pMON 1984 на тех же видах растений. pMON 1984 идентичен pMON 1982, за исключением того, что синтетический ингибитор протеаз (CMTI) слит с ним выше нативного сайта протеолитического расщепления. Уровни экспрессии инсектицидного токсина в табаке при использовании pMON 1984, как было оценено, подобны pMON 1982 между 10-15 нг на 50 мкг общего растворимого белка.
Растения томатов, содержащие pMON 1984, были защищены от повреждения листьев CPB. Оценка вреда была 0 со 100%-ной смертностью насекомых.
Картофель трансформировали, как описано в примере 5, вектором, подобным pMON 1982, содержащим усиленный CaMV 35S -синтетический B.t.t. ген. Листья растений картофеля, трансформированных этим вектором, скринировали с помощью биоанализа CPB насекомых. Из 35 протестированных растений листья четырех растений, 16a, 13c, 13d и 23a, были полностью защищены от повреждения насекомыми. Биоанализ насекомых на листьях трех других растений, 13e, 1a и 13b, продемонстрировал уровень повреждений, равный приблизительно 1 по шкале от 0 до 4 (4 - полное повреждение растительного материала). Иммунологический анализ подтвердил присутствие B.t.t. белка в листовой ткани. Уровень B.t.t. белка в листовой ткани растения 16a (величина повреждения 0) оценивали в 20-50 нг B.t.t. белка/50 мкг общего растворимого белка. Уровни B.t.t. белка в тканях растения 16a соответствуют их биологической активности. Иммунологический анализ растений 13e и 13b (ткань, уровень повреждения которой равнялся 1) выявил в них меньше белка (5-10 нг/50 мкг общего растворимого белка), чем в растении 16a. На разрезанное растение 16a помещали от 50 до 200 яиц CPB при анализе целого растения. При этих условиях на растении 16a не выявили повреждений и наблюдали 100%-ную смертность насекомых, в то время как растения картофеля были сильно поражены.
Пример 6. Синтетический B.t.k. ген P2 белка.
P2 белок - инсектицидный белок, продуцируемый некоторыми штаммами B.t., включая B.t.k. Он характеризуется активностью как против Lepidoptera, так и Diptera (Yamamoto T. and Iizuka T., Archives of Biochemistry and Biophysics (1983), v. 227, N 1, pp. 233-241). Гены, кодирующие P2 белок, выделены и охарактеризованы (Donovan W.P. et al., The J. of Biol. Chem. (1988), c. 263, N 1, pp. 561-567). P2 белок, кодируемый этими генами, имеет длину приблизительно 600 аминокислот. Эти белки имеют ограниченную гомологию со специфическими белками типа P1, обладающими активностью против бабочек, такими как B. t.k. HD-1 и HD-73 белки, описанные в предыдущих примерах.
P2 белки обладают активностью против большого разнообразия личинок Lepidoptera, включая капустный лупер, табачную бабочку-бражника и табачного червя почкового. Так как они обладают активностью против сельскохозяйственно важных насекомых-вредителей, P2 белки могут быть использованы для получения устойчивых к насекомым трангенных растений, слитых в комбинации с другими B. t. токсинами, описанными в вышеперечисленных примерах. В некоторых растениях экспрессии одного P2 белка может быть достаточно для того, чтобы обеспечить защиту растения от вредных насекомых, P2 белок может обеспечить защиту растений от двукрылых вредителей. Иногда экспрессия P2 вместе с B.t.k. HD-1 или HD-73 белком является предпочтительной. P2 белки при этом обеспечивают дополнительный уровень инсектицидной активности по сравнению с кристаллическим белковым токсином B.t.k. HD-1 или HD-73, а их комбинация может даже обеспечить синергическую активность. Хотя способ действия P2 белка неизвестен, исходя из его аминокислотной последовательности можно предположить, что он функционирует отлично от белков B.t.k. HD-1 и HD-73 типа. Продукция в растении белков, обеспечивающих их устойчивость к насекомым, но обладающих различными типами действия, сводит к минимуму возможность возникновения у насекомых устойчивости к B.t.k. белкам. Отсутствие существенной гомологии ДНК между P2 генами и HD-1 и HD-73 генами сводит к минимуму возможности для рекомбинации между этими генами, обеспечивающими устойчивость к насекомым, в растительной хромосоме.
Гены, кодирующие P2 белок, хотя отличны по последовательности от генов B.t.k. HD-1 и HD-73, имеют много общих черт с этими генами. В частности, гены P2 белка имеют высокий А+Г состав (65%), множественные последовательности потенциальных сигналов полиаденилирования (26) и многочисленные АТТТА последовательности (10). Из-за того, что они подобны слабо экспрессирующимся генам B.t.k. HD-1 и HD-73 дикого типа, возникают те же проблемы экспрессии гена P2 дикого типа. Основываясь на вышеописанном методе конструирования синтетических B.t. генов, синтетический P2 ген спланировали так, чтобы он мог экспрессироваться в растении в количестве, эффективном для защиты растений. Сравнение P2 генов дикого типа и синтетического показано в примере 13.
Пример 7. Синтетический B.t.Entomocidus ген.
B. t. entomocidus (Btent) белок - инсектицидный белок, продуцируемый некоторыми штаммами B. t. бактерий. Он обладает высоким уровнем активности против некоторых Lepidoptera, которые нечувствительны к B.t.k. HD-1 и HD-73, такие как виды Spodoptera, включая совку-карадрина (Visser B. et al., Mol. Gen. Genet. (1988), 212: 219-224). Гены, кодирующие этот белок, выделены и охарактеризованы (Honee G. et al., Nucleic Acids Research (1988), v. 16, N 13). Btent-белки, кодируемые этими генами, имеют приблизительно ту же длину, что и B.t.k. HD-1 и HD-73. Эти белки имеют приблизительно 68% гомологичных аминокислот с B.t.k. HD-1 и HD-73 белками. Похоже, что только N-терминальная часть - половина белка Btent необходима для проявления им инсектицидной активности, как в случае HD-1 и HD-73. Первые 625 аминокислот Btent белка имеют только 38% гомологии с аминокислотами HD-1 и HD-73.
Из-за их более высокой активности против видов Spodoptera, которые нечувствительны к HD-1 и HD-73 белкам, белки Btent желательно использовать для получения толерантных к насекомым трансгенных растений. Их можно использовать одни либо в комбинации с другими B.t.k. токсинами, описанными в вышеперечисленных примерах. В некоторых растениях продукция одного Btent-белка может быть достаточной для защиты от важных вредителей. В других растениях продукция двух отдельных белков обеспечивает защиту против целого ряда насекомых. Комбинация B.t.k. HD-1 или HD-73 типа белков плюс Btent-белков могла обеспечить, по меньшей мере, дополнительную инсектицидную эффективность, а также синергическую активность. В дополнение, поскольку он имеет другую аминокислотную последовательность, Btent-белок может обладать другим воздействием по сравнению с HD-1 или HD-73. Получение двух инсектицидных белков с различными типами действия в одном и том же растении могло бы сводить к минимуму возможности для возникновения устойчивости насекомых к этим белкам в растениях. Отсутствие гомологии в последовательности ДНК этого гена с генами B. t. k. типа сводит к минимуму возможности рекомбинации между рядом генов устойчивости к насекомым в растительных хромосомах.
Гены, кодирующие Btent-белок, хотя отличны по нуклеотидной последовательности от генов B.t.k. HD-1 и HD-73, однако имеют много общих черт с этими генами. В частности, гены белка Btent имеют высокий А+Т состав (62%), множественные потенциальные последовательности для сигналов полиаденилирования (39 в полноразмерной кодирующей последовательности и 27 в первых 1875 нуклеотидах, которые, по-видимому, кодируют активный фрагмент токсина) и многочисленные последовательности АТТТА (16 в полноразмерной кодирующей последовательности и 12 в первых 1875 нуклеотидах). Из-за его общей схожести со слабо экспрессирующимися B.t.k. HD-1 и HD-73 генами дикого типа Btent-гены дикого типа также плохо экспрессируются, как и HD-1 и HD-73 гены дикого типа. Основываясь на вышеописанном методе, использованном для конструирования синтетических B. t. генов, конструировали синтетический Btent-ген для экспрессии кодируемого им белка в количествах, обеспечивающих защиту растений. Сравнение Btent-генов дикого типа и синтетического показано на фиг. 38-42.
Пример 8. Синтетические B.t.k. гены для экспрессии в кукурузе.
Продемонстрировано усиление уровня экспрессии гетерологичных генов в кукурузных клетках в присутствии интрона гена кукурузы (Callis J., Fromm M. and Walbot V., Genes and Develop. (1987), 1: 1183-1200). Обычно эти интроны локализованы в 5' нетранслируемом районе химерного гена. Показано, что CaMV 35S промотор и 3' конец NOS эффективно функционируют в случае экспрессии гетерологичных генов в клетках кукурузы (Fromm M., Taylor L.P. and Walbot V. , Nature (1986), 319: 791-793).
Растительный кассетный вектор экспрессии (pMON 744) был сконструирован в результате объединения трех последовательностей. При этом кассета экспрессии включает усиленный CaMV 35S промотор, за которым следует интрон I Adh1 гена кукурузы (Callis J. et al., 1987). За ним расположен полилинкерный сайт клонирования для встраивания кодирующих последовательностей, этот полилинкер содержит, наряду с другими сайтами, сайт BglII. За полилинкером находится NOS 3' конец. pMON 744 также содержит генетический маркер, а именно ген 35S (N PTII) NOS 3' для селекции трансгенных клеток кукурузы по признаку канамицинустойчивости. В дополнение, pMON 744 имеет точку начала репликации E. coli и ген устойчивости к ампициллину для селекции плазмиды в клетках E.coli.
Пять B.t.k. кодирующих последовательностей, описанных в предыдущих примерах, встраивали в сайт BglII (pMON 744) для экспрессии в клетках кукурузы B. t. k.. Кодирующие последовательности встраиваемого гена и полученных векторов экспрессии были следующими:
B.t.k. HD-1 ген дикого типа из pMON 9921, получалась плазмида pMON 8652;
модифицированный B.t.k. HD-1 ген из pMON 5370, получалась плазмида pMON 8642;
синтетический B. t. k. HD-1 ген из pMON 5377, получалась плазмида pMON 8643;
синтетический B. t. k. HD-73 ген из pMON 5390, получалась плазмида pMON 8644;
синтетический полноразмерный B.t.k. HD-73 ген из pMON 10518, получалась плазмида pMON 10902.
pMON 8652 (B.t.k. HD-1 ген дикого типа) использовали для трансформации пропластов клеток кукурузы и выделяли стабильно трансформированный канамицинустойчивый каллюс. мРНК B.t.k. гена из клеток кукурузы анализировали с помощью нуклеазы SI. При этом было выявлено, что она присутствует в количестве, сравнимом с количеством мРНК, в случае использования для кодирующей последовательности дикого типа (pMON 9921) в трансгенных растениях томатов.
pMON 8652 и pMON 8642 (модифицированный HD-1 ген) использовали для трансформации протопластов клеток кукурузы. Уровень мРНК B.t.k. анализировали SI нуклеазой. Модифицированный HD-1 ген обеспечивал увеличение мРНК B.t.k. по сравнению с кодирующей последовательностью дикого типа в трансформированных клетках кукурузы в несколько раз. Это подтверждает тот факт, что модификации, введенные в B.t.k. HD-1 ген, обеспечивают усиление экспрессии B.t.k. белка в клетках, содержащих одну плазмиду, и растений и клеток, содержащих две плазмиды. pMON 8642 (модифицированный HD-1 ген) и pMON 8643 (синтетический HD-1 ген) использовали для трансформации клеток протопластов черной мексиканской сладкой кукурузы ПЭГ-зависимым способом введения ДНК, и стабильно трансформированный кукурузный каллюс отбирали на среде, содержащей канамицин. Индивидуальные колонии каллюса, которые происходили из одиночных трансформированных клеток, выделяли и выращивали отдельно на среде, содержащей канамицин.
Для того, чтобы выявить экспрессию B.t.k. генов в этих клетках, образцы каллюса тестировали на токсичность по отношению к насекомым с помощью биоанализа личинок табачной бабочки-бражника. Для каждого вектора тестировали 96 каллюсных линий. Порции каждого каллюса переносили на стерильные чашки с агаром, добавляли 5 однодневных личинок табачной бабочки-бражника и позволяли им питаться трансформированным каллюсом в течение 4 дн. При использовании pMON 8643 100% личинок погибало после выкармливания на 15-ти из 96 каллюсов, остальные каллюсы не вызывали большого вреда при его поедании. В случае использования pMON 8642 только 1 из 96 каллюсов был токсичен для личинок. Это подтверждает, что B.t.k. ген экспрессировался в этих образцах на инсектицидном уровне. Кроме того, было выявлено, что значительно большее число каллюсов, содержащих pMON 8643, было токсично для насекомых по сравнению с pMON 8642, это указывало на то, что были получены значительно более высокие уровни экспрессии белка, если в клетках кукурузы содержалась последовательность синтетического HD-1 гена по сравнению со случаем использования кодирующей последовательности модифицированного HD-1 гена. Полуколичественный иммуноанализ подтвердил, что токсичные образцы, содержащие pMON 8643, имели значительно большие уровни B.t.k. белка, чем токсичные образцы, содержащие плазмиду pMON 8642.
Образцы 16 каллюсов, которые были токсичны для табачной бабочки-бражника, также тестировались на активность против европейского точильщика кукурузы. Европейский точильщик кукурузы приблизительно в 40 раз менее чувствителен к продукту HD-1 гена, чем табачная бабочка-бражник. Личинок европейского кукурузного точильщика помещали на образцы каллюса и содержали в течение 4 дн. Два из 16 тестированных каллюса, содержащие pMON 8643 (синтетический HD-1 ген), были токсичны для личинки европейского кукурузного точильщика.
Чтобы выявить экспрессию генов B.t.k. в дифференцированных тканях кукурузы, использовали другой метод введения ДНК. Молодые листья срезали с растений кукурузы и образцы ДНК вводили в листовую ткань микропулевой бомбардировкой. В этой системе экспрессируемая ДНК на микропулях встраивается в клетках листьев после бомбардировки. Использовали три образца ДНК, и каждую ДНК исследовали три раза:
pMON 744, вектор экспрессии в кукурузе, нет B.t.k. гена;
pMON 8643 (синтетический HD-1 ген);
pMON 752, экспрессионный вектор, содержащий GUS ген, для клеток кукурузы B.t.k. гена нет.
Листья инкубировали при комнатной температуре 24 ч. pMON 752 образцы окрашивали на субстрате, который позволяет визуально выявить продукт GUS гена. Этот анализ показал, что свыше одной сотни пятен в каждом образце экспрессировали GUS продукт и образцы показывали очень сходные уровни GUS экспрессии. Для pMON 744 и pMON 8643 по 5 образцов личинок табачной бабочки-бражника добавляли на каждый лист и позволяли им кормиться 48 ч. Три образца, содержащие pMON 744, имели интересные повреждения из-за поедания их личинками при отсутствии их смертности. Три образца, содержащие pMON 8643, не имели повреждений, при этом наблюдали 100%-ную смертность личинок. Образцы анализировали на присутствие B.t.k. белка с помощью иммуноанализа. Все образцы с pMON 8643 содержали B.t.k. белок. Эти результаты демонстрируют, что синтетический B. t.k. ген экспрессируется в дифференцированных растительных тканях кукурузы на инсектицидном уровне.
Пример 9. Синтетический ген белка оболочки рольного вируса листьев картофеля.
Как показано, экспрессия в растениях генов белков оболочки разных растительных вирусов является эффективным методом для создания растений, устойчивых к этим вирусам. Для того, чтобы достичь устойчивости к вирусу, важно экспрессировать вирусный белок оболочки в эффективном количестве. Для многих генов белков оболочки растительных вирусов - это проблема. Для гена белка оболочки из вируса свертывания листьев картофеля PLRV экспрессию белка оболочки наблюдали на низком уровне по сравнению с другими генами белка оболочки, и этот низкий уровень белка не обеспечивал оптимальной устойчивости к PLRV.
Ген для белка оболочки PLRV показан на фиг. 44. На верхней строчке представлена нуклеотидная последовательность гена в том виде, как он был сконструирован в векторе pMON 893 для экспрессии в клетках растений. Этот ген содержит BglII-EcoRI фрагмент размером 749 нуклеотидов с кодирующей последовательностью, содержащейся между нуклеотидами 20 и 643. Этот фрагмент также содержит 19 нуклеотидов 5' некодирующей последовательности и 104 нуклеотида 3' некодирующей последовательности. Этот PLRV ген белка оболочки слабо экспрессируется в растениях по сравнению с другими генами вирусных белков оболочки.
Для улучшения экспрессии PLRV белка оболочки в клетках растений получали синтетический ген. Изменения, сделанные в синтетическом PLRV гене, показаны в нижней строчке (см. фиг. 44). Этот ген кодирует такой же белок, что и ген дикого типа. Заметьте, что начало синтетического гена - в 14 нуклеотиде и конец последовательности - в 654 нуклеотиде. Кодирующая последовательность для синтетического гена расположена с 20 нуклеотида по 643. Замены, указанные выше и ниже этих концов, служат для введения подходящих сайтов рестрикции за кодирующей последовательностью. Таким образом, размер синтетического гена - 641 нуклеотид меньше гена дикого типа. Синтетический ген меньше, потому что вся некодирующая последовательность как на 5', так и на 3' конце, за исключением сегментов, кодирующих BglII и EcoRI сайты рестрикции, удалена.
Синтетический ген имеет следующие отличия от гена дикого типа. Во-первых, 41 индивидуальных кодона внутри кодирующей последовательности заменены для почти всех кодонов для данной аминокислоты, которые составляют менее чем около 15% кодонов для аминокислот из обзора всех растительных генов растений -двойных хозяев. Во-вторых, 5' и 3' некодирующие последовательности гена дикого типа удалены. Несколько замен кодонов и особенно удаление длинного 3' некодирующего района согласуются с алгоритмом, описанным на фиг. 1.
PLRV последовательность дикого типа содержит два потенциальных растительных сигнала полиаденилирования (ААЦЦАА и ААГЦАТ), оба они встречаются в 3' некодирующем районе, который удален в синтетическом гене. PLRV ген дикого типа также содержит ATTTA последовательность и 3' некодирующую последовательность. В середине гена находится самый длинный район непрерывных A+T (район 7 А+Т нуклеотидов). Эту последовательность удаляли в синтетическом гене. Таким образом, последовательности синтетического гена PLRV белка оболочки были заменены в соответствии с алгоритмом мишеней для замен (см. фиг. 1) путем удаления 3' некодирующего сегмента. Внутри кодирующей последовательности были осуществлены замены кодонов для того, чтобы удалить три других района последовательности, которые описаны выше. В частности, в синтетическом гене были удалены два района из 5 последовательных А+Т и один район из 5 непрерывных Г+Ц внутри кодирующей последовательности.
Синтетический PLRV ген белка оболочки клонировали в векторе трансформации растений, таком как pMON 893, и использовали для трансформации растений картофеля. Эти растения экспрессировали белок оболочки PLRV на более высоком уровне, чем уровень, достигнутый при использовании гена дикого типа. Растения, содержащие синтетический ген, обладали повышенной резистентностью к инфекции PLRV.
Пример 10. Экспрессия синтетических B.t. генов под контролем промоторов малой субъединицы RUBISCO, а также при использовании транспортных и пептидов хлоропластов.
Гены растений, кодирующие малую субъединицу RUBISCO SSU, часто эффективно экспрессируются, легко регулируются и обладают тканевой специфичностью. Эти свойства главным образом обусловлены промотором этих генов. Ранее использовали SSU промоторы для экспрессии гетерологичных генов в трансформированных растениях. Обычно растения содержат множественные SSU гены, уровни экспрессии и тканевая специфичность которых различна. SSU белки закодированы в ядре, а синтезируются в цитоплазме как предшественники, содержащие N-терминальную избыточность, являющуюся хлоропластным транспортным пептидом (CTP). CTP направляет предшественник в хлоропласты и облегчает поступление SSU белка в хлоропласт. При этом CTP отрезается от SSU белка. CTP последовательности использовались для направления гетерологичных белков в хлоропласты трансформированных растений.
SSU промоторы обладают рядом преимуществ при экспрессии B.t.k. генов в растениях. Некоторые SSU промоторы обеспечивают значительное увеличение уровней экспрессии до или выше уровней, получаемых при использовании CaMV 35S промотора. Тканевое распределение продуктов экспрессии под контролем SSU промоторов отличается от распределения продуктов экспрессии под контролем CaMV 35S промотора. Иногда для контроля численности некоторых насекомых-вредителей предпочтительно обеспечивать экспрессию B.t.k. белков в тех клетках, в которых SSU промоторы обеспечивают больший уровень экспрессии. Например, конститутивный в листьях растений CaMV 35S промотор обеспечивает более высокую экспрессию в сосудистой ткани, чем в некоторых других частях листа, в то время как большинство SSU промоторов более высоко экспрессируются в мезофильных клетках листа. Некоторые SSU промоторы более тканеспецифичны, так что возможна утилизация специфичности SSU промотора для того, чтобы обеспечить экспрессию B.t.k. белка только в одном типе растительных тканей, если, например, экспрессия B.t.k. белка в определенных клетках вредна для них. Например, для контроля численности колорадского жука на картофеле предпочтительно использовать SSU промоторы для того, чтобы направлять экспрессию B.t.k. белка в листья, а не в съедобные клубни.
Использование SSU CTP последовательности для локализации белков в хлоропластах также может быть выгодно. Локализация B.t.k. белка в хлоропластах могла бы, по-видимому, защитить эти белки от протеаз, находящихся в цитоплазме, что привело бы к стабилизации B.t.k. белков, а следовательно, к более высоким уровням аккумуляции активного белка. B.t.k. гены, содержащие CTP, могли бы быть использованы с SSU промотором или с другим промотором, таким как CaMV 35S.
Огромное разнообразие векторов трансформации растений было сконструировано для экспрессии B.t.k. генов с использованием SSU промоторов и SSU CTP. Используемые промоторы и CTP происходили из гена петуньи SSUIIa, описанного Tumer и соавт. (Tumer N. E. et al., Nucleic Acids Res. (1986), v. 14, 8: 3325) и из гена (SSU ген) Arabidopsis ats. 1A, описанного Krebbers и соавт. (Krebbers E. et al., Plant Molecular Biology (1988), 11: 745-759) и Elionor с соавт. (Elionor R.P. et al., Mol. Gen. Genet. (1989), 218: 78-86). Промотор SSU IIa петуньи содержится на фрагменте ДНК, который простирается приблизительно на 800 пн выше SSU кодирующей последовательности. Промотор Arabidopsis ats.1A расположен на фрагменте ДНК, который простирается приблизительно на 1,8 тпн выше SSU кодирующей последовательности. Использовали верхние концевые удобные сайты полилинкера (pUC18) для встраивания этих промоторов в векторы трансформации растений, такие как pMON 893. Эти промоторы расположены вплоть до начала SSU кодирующей последовательности. В точке начала создавали NcoI сайт для встраивания B.t. кодирующей последовательности взамен на SSU кодирующую последовательность.
При использовании SSU промоторов в комбинации с их CTP, в точке слияния кодирующей последовательности CTP и небольшой части зрелой SSU кодирующей последовательности был введен NcoI сайт, что позволило объединить в рамке считывания B.t. кодирующие последовательности с CTP. В частности, в случае с CTP SSU IIa последовательностью петуньи B.t. кодирующие последовательности были соединены с SSU последовательностью после восьмой аминокислоты зрелой SSU последовательности в NcoI сайт. Восемь аминокислот зрелой SSU последовательности встраивали в рекомбинантную ДНК, потому что предварительные эксперименты по введению ДНК в хлоропласты in vitro показывали, что экспрессия B. t. наблюдалась, только если этот сегмент содержал зрелую SSU последовательность. В случае использования Arabidopsis ats.1A CTP встраивали полную CTP, 24 аминокислоты зрелой SSU последовательности и терминирующую последовательность Gly-Gly-Arg-Val-Asn-Cys-Met-Gln-Ala-Met в NcoI сайт для слияния с B. t. последовательностью. Эта короткая последовательность соответствует сайту расщепления нативного SSU CTP (между Cys и Met) и содержит короткие последовательности, расположенные рядом с сайтом расщепления. Эту последовательность встраивали для того, чтобы обеспечить введение ДНК в хлоропласты. Последовательности, кодирующие B. t. белок, были слиты с этим ats 1AA CTP после Met кодона. Эксперименты in vitro с этой CTP конструкцией и другими кодирующими последовательностями подтвердили, что этот CTP обеспечивает перенос белков-мишеней в хлоропласты.
В комбинации с промотором CaMV 35S использовали те же CTP сегменты. Их вырезали из последовательности, расположенной перед АТГ стартовым кодоном CTP, вводили BglII сайт и помещали ниже CaMV 35S промотора в плазмиде pMON 835 в виде BglII-NcoI фрагмента. Кодирующие последовательности B.t. белка сливали, как описано выше.
Последовательность, кодирующая B. t.k. HD-1 дикого типа pMON 9921 (см. фиг. 1), была слита с ats 1A промотором, в результате была получена pMON 1921. Эти векторы экспрессии использовали для трансформации растений табака. Полученные растения скринировали на активность против табачной бабочки-бражника. Не было обнаружено ни одного токсичного для насекомых растения. Это удивительно, поскольку токсичные растения выявляются пусть даже с низкой частотой после трансформации плазмидой pMON 9921, в которой последовательность, кодирующая B. t.k., экспрессируется с усиленного CaMV 35S промотора pMON 893, а также исходя из того, что сообщают Elionor с соавт. (Elionor R. P. et al., 1989), что ats 1A промотор сравним по силе с CaMV 35S промотором и приблизительно в 10 раз сильнее его, если включена CTP последовательность, по меньшей мере для последовательности, кодирующей B.t.k. HD-1 дикого типа.
Конструировали множество векторов для трансформации растений с использованием либо усеченной синтетической кодирующей последовательности HD-73 (фиг. 4), либо полноразмерной B.t.k. HD-73 последовательности, кодирующей B. t.k. HD-73 (фиг. 27-31). Они перечислены в табл. 15.
Все эти векторы экспрессии использовали для трансформации растений табака. При использовании векторов, содержащих усеченные B.t.k. гены, листовую ткань из трансформированных растений анализировали на токсичность для насекомых и на содержание B.t.k. белка с помощью иммуноанализа. Растения, трансформированные pMON 10806, 10811, 10819 и 10821, продуцируют B.t.k. белок на уровне, сравнимом с растениями, содержащими pMON 5383 и pMON 5390, с синтетическими кодирующими последовательностями B.t.k. HD-73, под контролем En 35S промотора без CTP. Эти растения обладают инсектицидной активностью, которая совпадает с ожидаемым уровнем содержания B.t.k. белка. При использовании pMON 10815 и pMON 10817 (содержащих ats 1A промотор) уровень B.t.k. белка был приблизительно в 5 раз выше, чем выявленный в растениях, содержащих pMON 5383 или 5390. Эти растения также обладали высокой инсектицидной активностью. Растения с pMON 10815 и pMON 10817 содержали до 1% B.t.k. HD-73 белка от общего растворимого белка листьев. Они имели наивысший уровень B.t. k. белка, получаемого с любым из синтетических генов.
Этот результат удивителен по двум причинам. Во-первых, как указано выше, последовательности гена дикого типа, слитые с ats 1A промотором и CTP, не продемонстрировали более высоких уровней экспрессии по сравнению с En 35S, которые фактически обладали более низкой экспрессией, и не было выявлено ни одного инсектицидного растения. Во-вторых, показано (Elionor R.P. et al., 1989), что ats 1A CTP увеличивает экспрессию двух других генов под контролем ats 1A промотора приблизительно в 10 раз. Для синтетического B.t.k. HD-73 гена не выявлено увеличения экспрессии при встраивании CTP над и выше ats 1A промотора.
Растения табака, содержащие полноразмерный синтетический HD-73 ген, слитый с SSU IIa CTP под контролем En 35S промотора, содержали B.t.k. белки и обладали инсектицидной активностью, сравнимой с растениями, трансформированными pMON 1518, которая не содержит CTP. В дополнение, в случае с pMON 10518 B.t.k. белок, экстрагированный из растений, подвергали электрофорезу в геле и наблюдали, что он содержит множество полноразмерных форм белка, что, по-видимому, обусловлено отщеплением C-терминальной части, которая не требуется для обеспечения токсичности в цитоплазме. В случае с pMON 10814 большинство белков были интактными полноразмерными, что указывало на то, что этот белок защищен от протеолиза и переносится в хлоропласт.
Пример 11. Перенос B.t. белков во внеклеточное пространство или вакуоль с использованием сигнальных пептидов.
B. t. белки, получаемые при использовании синтетических генов, описанных в заявке, локализованы в цитоплазме растительной клетки, и эта цитоплазматическая локализация обеспечивает инсектицидную активность растений. Для некоторых целей более предпочтительно направлять B.t. белки в другие отделения растительной клетки. Локализация B.t. белков в других отделах, чем цитоплазма, может обеспечить меньшее повреждение B.t. белков цитоплазматическими протеазами, что, по-видимому, может обеспечить усиленную инсектицидную активность. Внеклеточная локализация может обеспечить более эффективную доступность B.t. белков для некоторых насекомых. Было обнаружено, что B.t. белок вреден для функционирования растительной клетки, поэтому его локализация вне цитоплазматических отделов могла бы защищать эти клетки от белка.
В растениях, также как и в других эукариотах, белки, предназначенные для локализации во внеклеточном пространстве или в некоторых специфических органеллах, обычно синтезируются с N-терминальной концевой избыточностью, известной под названием "сигнальный пептид". Этот сигнальный пептид обеспечивает поступление белка в соответствующий отдел клетки, и он обычно отщепляется от зрелого белка на ранней стадии выделения. Для внеклеточного белка секреторный путь обычно включает котрансляционное включение в эндоплазматический ретикулум с отщеплением сигнального пептида, происходящим на этой стадии. Зрелый пептид затем проходит через аппарат Гольджи в везикулы, которые сливаются с плазматической мембраной, таким образом перенося белок во внеклеточное пространство. Белки, переносимые в эндоплазматический ретикулум или аппарат Гольджи, следуют этой схеме, но они остаются в соответствующем отделе. Некоторые белки растений поступают в вакуоли, еще один мембранный отдел в цитоплазме многих растительных клеток. В аппарате Гольджи эти белки поступают в везикулы, которые сливаются с вакуолью.
Все эти белки содержат сигнальный пептид, который обеспечивает процесс их выделения. Слияние сигнального пептида с белком во многих случаях приводит к поступлению этого белка в эндоплазматический ретикулум. Эффективность этой стадии может зависеть от последовательности самого зрелого белка. Сигналы, которые направляют белок в специфический отдел клетки, не изучены. Многие сигналы, которые обеспечивают поступление белка в специфические отделы клетки, содержатся внутри аминокислотной последовательности зрелого белка. Это было продемонстрировано для некоторых белков, поступающих в вакуоли, однако еще нет возможности определить эти последовательности однозначно. Предполагается, что секреция во внеклеточное пространство является "банкротным" путем для белка, содержащего сигнальную последовательность, но не имеющего другого сигнала выделения. Таким образом, для локализации B.t. белков вне цитоплазмы необходимо слить синтетические B.t. гены с последовательностями ДНК, кодирующими известные растительные сигнальные пептиды. Эти слитые гены будут обеспечивать увеличение количества B.t. белков, поступающих в секреторный путь, и приводить к внеклеточной секреции или перемещению их в вакуоли или другие отделы.
Описаны сигнальные последовательности для нескольких растительных генов. Одна такая последовательность (специфичная для патогенеза родственного PR 1b табачного белка) описана (Cornellssen B.J.C. et al., EMBO J., 1986, v.5. N 1, 37 - 40). PR 1b белок обычно локализован во внеклеточном пространстве. Еще один тип сигнального пептида выявлен у запасных белков бобов. Эти белки локализуются в белковых телах семян, которые являются вакуолеподобным отделом, который присущ семенам. Описана последовательность ДНК сигнального пептида для бета-субъединицы 7S запасного белка обычной фасоли (Phaseolus vulgaris) PvuB (Doyle J.J. et al., J. Biol. Chem. (1986), v, 261, N 20, 9228 - 9236). На основании этих последовательностей путем химического синтеза олигонуклеотидов были получены синтетические гены, которые кодируют сигнальные пептиды для PR 1b и PvuB. Синтетические гены этих сигнальных пептидов точно совпадали с описанными последовательностями ДНК. Выше кодона инициации трансляции каждого сигнального пептида вставляли BamH1 и BglII сайты (BamH1 сайт на 5'конце). Это позволяло вставлять кодирующие фрагменты сигнального пептида в BglII сайт pMON 893 для экспрессии под контролем En 35S промотора. В некоторых случаях для достижения секреции или выделения гетерологичных белков было необходимо включать некоторую аминокислотную последовательность вне нормального сайта расщепления сигнального пептида. Это было необходимо для того, чтобы убедиться в правильном отщеплении сигнального пептида. В синтетическую последовательность ДНК для PR 1b также включали первые 10 аминокислот зрелой PR 1b. Синтетическая последовательность ДНК включала первые 13 аминокислот зрелого PvuB. Оба синтетических сигнальных пептида кодировались фрагментами ДНК, оканчивающимися Ncol сайтами, что позволяло сливать их в пределах рамки считывания с Met инициаторным кодоном синтетических B.t. генов.
Были сконструированы четыре вектора экспрессии, содержащих последовательности для этих сигнальных пептидов и B.t.k. HD-73 гены. Синтетические усеченный HD-73 ген из pMON 5383 слили с последовательностью сигнального пептида PvuB и встроили в pMON 893 для создания pMON 10827. Усеченный синтетический HD-73 ген из pMON 5383 был также слит с последовательностью сигнального пептида PR 1b для создания pMON 10824. Полноразмерный синтетический HD-73 ген из pMON 10518 был слит с последовательностью сигнального пептида PvuB и встроен в pMON 893 для создания pMON 10828.Полноразмерный синтетический HD-73 ген из pMON 10518 также был слит с последовательностью сигнального пептида РR 1b и встроен в pMON 893 для создания pMON 10825.
Эти векторы экспрессии использовали для трансформации растений табака, и растения анализировали на экспрессию B.t.k. белка Вестерн-блот-анализом и на инсектицидную активность. Растения, трансформированные pMON 10824 и pMON 10827, продуцировали в листьях B.t.k. белок в количестве, сравнимом с количеством, полученным от усеченных HD-73 генов. Растения, трансформированные pMON 5383 и pMON 5390, pMON 10825 и pMON 10828, продуцировали полноразмерный B. t.k. белок в количествах, сравнимых с количеством, полученным при использовании pMON 10518. Во всех случаях растения обладали инсектицидной активностью против табачной бабочки-бражника.
Область использования: биотехнология, в частности, генная инженерия. Сущность изобретения: способ модификации фрагмента ДНК, кодирующего инсектицидный белок Bacillus thuringiensis, варианты фрагментов ДНК, кодирующих инсектицидный белок Bacillus thuringiensis, варианты фрагмента ДНК, содержащего структурный ген, кодирующий инсектицидный белок, и фрагмент ДНК, содержащий структурный ген, кодирующий слитый белок, включающий 610 N-терминальных аминокислот, полученных из Bacillus thuringiensis kurstaki HP-1, и 567 С-терминальных аминокислот белка токсина, полученного из Bac. thuringiesis kurstaki HD-73. 12 с. и 1 з.п.ф-лы, 15 табл., 44 ил.
ААТААА, ААТААТ, ААССАА, АТАТАА, ААТСАА, АТАСТА, АТАААА, ATGAAA, AAGCAT, ATTAAT, ATACAT, AAAATA, ATTAAA, AATTAA, AATACA, CATAAA и АТТТА,
сохраняя при этом последовательность, кодирующую инсектицидный белок.
| Daeck M | |||
| et.al | |||
| Transgenic plants protected from insect attack, Nature, 1987, v.328, p.39. |
