ИММУНОМОДУЛЯТОР Российский патент 2005 года по МПК A61K31/205 A61P37/00 

Изобретение относится к новым биологически активным веществам из класса гетероалканкарбоновых кислот и может быть использовано в медицине и биологии в качестве основы для создания лекарственных препаратов.

В последнее время уделяют много внимания разработке и изучению специфических средств, стимулирующих или подавляющих иммунные реакции организма. Существующие в настоящее время иммунотропные препараты не обладают достаточной избирательностью действия, и их применение может сопровождаться выраженными побочными явлениями. Гетероциклический иммуномодулятор левамизол (М.Д.Машковский, Лекарственные средства, М., Медицина, 1986, т.2, стр.169-170) может выполнять функции иммуномодулятора, способного усилить слабую реакцию клеточного иммунитета, ослабить сильную и не действовать на нормальную. Левамизол проявляет дозозависимое воздействие на иммунитет и применять его, например, в качестве иммуностимулятора нужно с осторожностью, так как при превышении доз возможно не иммуностимулирующее, а иммунодепрессивное действие, причем в некоторых случаях от малых доз левамизола. Применение левамизола может вызвать различные побочные явления. Клинические испытания показали, что у 30-40% больных, получающих левамизол, зарегистрированы разнообразные осложнения: головная боль, нарушение сна, аллергические реакции, агранулоцитоз, лейкопения.

Современные знания о патогенезе многих заболеваний, связанных с нарушением межклональных взаимоотношений Т-хелперов 1-го и 2-го типов и баланса соответствующих им цитокинов выдвигают требования к поиску новых иммуномодулирующих препаратов. В связи этим представляют интерес препараты, проявляющие при первичном скрининге in vivo на интактных животных разнонаправленное действие на интегральные показатели-антителообразование и ГЗТ, оказывающие влияние либо только на гуморальный, либо только на клеточный иммунитет и не оказывающие токсического воздействия на организм.

Целью изобретения является расширение арсенала синтетических средств, обладающих иммуномодулирующими свойствами.

Для достижения этой цели предлагается использовать трис-(2-оксиэтил)аммониевую соль 2-хлорфеноксиуксусной кислоты в качестве иммуномодулятора.

Трис-(2-оксиэтил)аммониевая соль 2-хлорфеноксиуксусной кислоты обладает антиоксидантными свойствами (“Клиническая эффективность и безопасность цефалоспориновых антибиотиков производства ООО “АБОЛмед” сб. трудов НИИКИ, АГМУ и МКБ, Новосибирск, 2002, стр.179).

Сущность изобретения заключается в том, что были исследованы иммуномодулирующие свойства трис-(2-оксиэтил)аммониевой соли 2-хлорфеноксиуксусной кислоты по способности данного соединения влиять на количество ядросодержащих клеток крови у мышей (миелоактивные свойства), на количество антителообразующих клеток (АОК) in vivo (первичный гуморальный иммунный ответ), на реакцию ГЗТ (клеточный иммунитет), на спонтанную и митогенстимулированную пролиферацию спленоцитов у мышей in vitro (иммунопролиферативных свойства).

В работе использовали здоровых половозрелых животных мышей-гибридов (CBAxC57BL/6)F1 (CBF1) обоего пола, 8-10 недельного возраста, массой тела 18-20 г. Разброс в группах по исходной массе тела не превышал ±10%. Контрольные и опытные животные одного возраста и получены одновременно из одного питомника ("Рассвет", г. Томск). До и в период эксперимента контрольные и опытные животные содержались в виварии в одинаковых условиях: стандартных пластиковых клетках с мелкой древесной стружкой (не более 10 особей) на стандартном рационе. Все исследования проводились в одно и то же время суток (утром).

Данные обрабатывались по непараметрическому критерию U Вилкоксона-Манна-Уитни.

Пример 1. Определение миелоактивных свойств.

LD₅₀ для соединения при внутрибрюшинном введении составляет 1500 мг/кг. Опытной группе животных соединение вводили в дозе 1/10 LD₅₀ внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл ежедневно в течение 7 дней, через 24 часа после последнего введения определяли количество ядросодержащих клеток в периферической крови.

Контрольным животньм в таком же объеме и режиме вводили растворитель (воду). Критерием оценки миелоактивных свойств является изменение в лейкоцитарной формуле ±20%. Результаты выражали в количестве лейкоцитов в одном мл крови и в процентах к соответствующему контролю.

Таблица 1Влияние трис-(2-оксиэтил)аммониевой соли 2-хлорфеноксиуксусной кислоты на количество ядросодержащих клеток крови у интактных мышей CBF1.ГруппаДоза 1/10 LD₅₀ (мг/кг)Кол-во ядросодержащих клеток% к контролюКонтроль 9,87×10⁶/мл Соединение15013,3×10⁶/мл*+34*достоверно, Р<0,05

Как видно из табл. 1, соединение достоверно обладает миелостимулирующими свойствами, т.е. более, чем на 30% вызывает увеличение количества лейкоцитов в периферической крови.

Пример 2. Оценка влияния соединения на первичный гуморальный иммунный ответ.

Соединение в дозе 1/10 LD₅₀ (150 мг/кг) в объеме 0,5 мл растворителя вводили внутрибрюшинно один раз в сутки ежедневно в течение 7 дней и в дозе 1/100 LD₅₀ (15 мг/кг) в объеме 0,5 мл растворителя вводили внутрибрюшинно один раз в сутки ежедневно в течение 7 дней. Контрольным животньм в таком же объеме и режиме вводили растворитель соединения (воду). В день последнего введения соединения животных иммунизировали внутривенно эритроцитами барана (ЭБ) в дозе 0,5×10⁷/мышь. Количество IgM АОК в селезенке мышей оценивали на 4-е сутки после иммунизации по количеству зон локального гемолиза в полужидкой среде модифицированным методом Cunningham (1968). Результаты выражали в абсолютном количестве IgM АОК в селезенке.

Таблица 2Абсолютное количество IgM AOK в селезенке интактных мышей CBF1 под влиянием курсового введения трис-(2-оксиэтил)аммониевой соли 2-хлорфеноксиуксусной кислотыГруппыДоза 1/10 LD₅₀ (мг/кг)IgM AOK/ Селез.Доза 1/100 LD₅₀ (мг/кг)IgM AOK/ Селез.Контроль 1839 1839Соединение1507689*151739* достоверно, Р<0,05

Как видно из данных таблицы 2, трис-(2-оксиэтил)аммониевая соль 2-хлорфеноксиуксусной кислоты проявляет выраженный достоверный стимулирующий эффект на первичный гуморальный ответ в дозе 150 мг/кг.

Пример 3. Оценка соединения на гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ) in vivo.

Соединения в дозе 1/10 LD₅₀ и 1/100 LD₅₀ в объеме 0,5 мл вводили внутрибрюшинно один раз в сутки ежедневно в течение 5 дней. Контрольным животным в таком же объеме и режиме вводили растворитель соединений (воду). В день последнего введения соединений сенсибилизировали мышей внутрибрюшинным введением 0,25% ЭБ в объеме 0,5 мл, на 4-е сутки после сенсибилизации вводили разрешающую дозу антигена под подошвенный апоневроз правой задней лапы (50% ЭБ в объеме 50 мкл). В контрлатеральную лапу вводили растворитель в том же объеме. Контрольным животньм в таком же объеме и режиме вводили растворитель соединений (воду). Реакцию ГЗТ оценивали по методике локальной ГЗТ (Crowle, 1975). Учет реакции производили через 24 часа после введения разрешающей дозы ЭБ, величину отека оценивали штангенциркулем. Результаты выражали в процентах или абсолютных значениях.

Таблица 3Влияние курсового введения соединения в дозе 1/10 и 1/100 LD₅₀ на гиперчувствительность замедленного типа у интактных мышей CBF1.Шифр соединенияДоза 1/10 LD₅₀ (мг/кг)ГЗТ (%)Доза 1/100LD₅₀ (мг/кг)ГЗТ (%)Контроль 47,5 47,5Соединение15040,41537,0**достоверно, Р<0,05

Как видно из данных табл.3, соединение достоверно подавляет ГЗТ в дозе 1/100 LD₅₀ - 15 мг/кг, т.е. достоверно подавляет Т-клеточный иммунитет.

Пример 4. Оценка иммунопролиферативных свойств соединения.

Клетки селезенки мышей культивировали в круглодонных планшетах для иммунологических реакций ("Linbro") при +37°С в атмосфере 5% СО₂ и 95% воздуха. Абсолютное количество клеток, вносимых в лунку, составляло 200 000. Клетки стимулировали митогенами - конканавалиномА (Con A, Sigma) или митогеном лаконоса (PWM, Sigma). Концентрации митогенов подбирались предварительным титрованием и использовались в оптимальной дозе, что составило для Con A 2 мкг/мл, а для PWM -1 мкг/мл. Соединение в трех дозах вносили в лунки одновременно с митогенами. Пролиферативную активность клеток оценивали по включению Н³-тимидина в ДНК делящихся клеток. Метку вносили за 16 час до конца культивирования по 1 мкКи в каждую лунку планшета. Для этого основной раствор Н³-тимидина сначала растворяли в среде RPMI-1640 до концентрации 100 мкКи/мл, а затем по 10 мкл раствора добавляли в каждую лунку планшета. По окончании инкубации клетки собирали на стеклянно-волокнистые фильтры ("Flow Lab") с помощью аппарата Harvester ("Titertek"). Фильтры высушивали и помещали во флаконы для сцинтилляционного счета, и радиоактивность подсчитывали в толуольном сцинтилляторе (4 г дифенилоксазола, 0,1 г дифенил-оксазолилбензола на 1 л толуола) в жидкостном сцинтилляционном счетчике "Delta" (США). Результаты выражали в имп/мин включенного тимидина на 2×10⁵ клеток, представлены средние данные по триплету.

Таблица 4Влияние трис-(2-оксиэтил)аммониевой соли 2-хлорфеноксиуксусной кислоты на спонтанную и митоген-стимулированную пролиферацию клеток селезенки интактных мышей in vitro (имп/мин).Доза соединения (мкг/мл)Спонтанная пролиферацияCon А-индуцирован Пролиферация (2 мкг/мл)PWM-Индуцированная пролиферация (1 мкг/мл)Контроль33051514068961,534861429572581530561529064531502036*14034*5308** достоверно соответствующего контроля, Р<0,05

Как видно из таблицы 4, соединение способно в дозе 150 мкг/мл оказывать достоверное ингибирующее действие на иммунопролиферативную активность (спонтанную и митоген-стимулированную пролиферацию) клеток селезенки мышей.

Оценивая в целом полученные результаты, можно отметить, что избирательное воздействие исследуемого соединения на иммунные реакции организма: стимулирующее влияние на миелоактивность и первичный гуморальный ответ и супрессивное влияние на гиперчувствительность замедленного действия, а также на спонтанную и митоген-стимулированную пролиферацию клеток селезенки интактных мышей, позволяет констатировать наличие у трис-(2-оксиэтил) аммониевой соли 2-хлорфеноксиуксусной кислоты иммуномодулирующих свойств, что может в будущем послужить основой для создания новых лекарственных средств, предназначенных для лечения инфекционно-воспалительных, аутоиммунных и лимфопролиферативных заболеваний.

Предложено: применение трис-(2-оксиэтил)аммониевой соли 2-хлорфеноксиуксусной кислоты, ранее известной как гербицид, в качестве иммуномодулятора. Изобретение позволяет создать препараты, направленные на стимуляцию миелоактивности и на подавление гиперчувствительности замедленного типа для лечения инфекционно-воспалительных, аутоиммунных и лимфопролиферативных заболеваний. 4 табл.

Применение трис-(2-оксиэтил)аммониевой соли 2-хлорфеноксиуксусной кислоты в качестве иммуномодулятора.