ИММУНОМОДУЛЯТОР Российский патент 2005 года по МПК A61K31/192 A61P37/02 

Изобретение относится к новым биологически активным веществам из класса алкан-карбоновых кислот и может быть использовано в медицине и биологии в качестве основы для создания лекарственных препаратов.

Известен ряд препаратов, модулирующих иммунные реакции. К иммуномодуляторам относятся вещества, специфически воздействующие на клеточную и гуморальную систему иммунитета, избирательно подавляя или стимулируя иммунный ответ.

Гетероциклический иммуномодулятор левамизол (М.Д.Машковский, Лекарственные средства, М., Медицина, 1986, т.2, стр.169-170) может выполнять функции иммуномодулятора, способного усилить слабую реакцию клеточного иммунитета, ослабить сильную и не действовать на нормальную. Левамизол проявляет дозозависимое воздействие на иммунитет и применять его, например, в качестве иммуностимулятора нужно с осторожностью, так как при превышении доз возможно не иммуностимулирующее, а иммунодепрессивное действие, причем в некоторых случаях от малых доз левамизола. Применение левамизола может вызвать различные побочные явления. Клинические испытания показали, что у 30-40% больных, получающих левамизол, зарегистрированы разнообразные осложнения: головная боль, нарушение сна, аллергические реакции, агранулоцитоз, лейкопения. Современные знания о патогенезе многих заболеваний, связанных с нарушением межклональных взаимоотношений за счет расстройства Th1/Th2 регуляторных влияний и баланса соответствующих цитокинов, выдвигают требования к поиску новых иммуноактивных препаратов. В связи этим представляют интерес препараты, проявляющие при первичном скрининге in vivo на иктактных животных разнонаправленное влияние на интегральные показатели - антителообразование и ГЗТ, оказывающие влияние либо только на гуморальный, либо только на клеточный иммунитет и не оказывающие токсического воздействия на организм. С целью расширения арсенала синтетических средств, обладающих иммуномодулирующими свойствами, предлагается использовать трис-(2-оксиэтил) аммониевую соль 2,4-дихлор-феноксиуксусной кислоты в качестве иммуномодулятора. Трис-(2-оксиэтил) аммониевая соль 2,4-дихлор-феноксиуксусной кислоты обладает антиоксидантными свойствами (“Клиническая эффективность и безопасность цефалоспориновых антибиотиков производства ООО “АБОЛмед” сб. трудов НИИКИ, АГМУ и МКБ, Новосибирск, 2002, стр.179).

Сущность изобретения заключается в том, что были исследованы иммуномодулирующие свойства трис-(2-оксиэтил) аммониевой соли 2,4-дихлор-феноксиуксусной кислоты по способности данного соединения влиять на количество ядросодержащих клеток крови у мышей (миелоактивные свойства), на количество IgM антителообразующих клеток in vivo (первичный гуморальный ответ), реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) - (клеточный иммунитет), на спонтанную и митоген-стимулированную пролиферацию спленоцитов у мышей in vitro (антипролиферативные свойства).

В работе использовали здоровых половозрелых животных - мышей гибридов (CBAxC57BL16)F1 (CBF1) обоего пола, 8-10 недельного возраста, массой тела 18-20 г. Разброс в группах по исходной массе тела не превышал ±10%. Контрольные и опытные животные одного возраста и получены одновременно из одного питомника ("Рассвет", г. Томск). До и в период эксперимента контрольные и опытные животные содержались в виварии в одинаковых условиях: стандартных пластиковых клетках с мелкой древесной стружкой (не более 10 особей) на стандартном рационе. Все исследования проводились в одно и то же время суток (утром). Данные обрабатывались по непараметрическому критерию U Вилкоксона-Манна-Уитни.

Пример 1. Оценка миелоактивных свойств соединения.

Опытной группе животных соединение вводили в дозе 1/10 LD₅₀ внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл ежедневно в течение 7 дней, через 24 часа после последнего введения определяли количество ядросодержащих клеток в периферической крови. Контрольным животным в таком же объеме и режиме вводили растворитель (воду). Критерием оценки миелоактивных свойств является изменение в лейкоцитарной формуле ±20%. Результаты выражали в количестве лейкоцитов в одном мл крови и в процентах к соответствующему контролю.

Таблица 1
Влияние трио-(2-оксиэтил) аммониевой соли 2,4-дихлор-феноксиуксусной кислоты на количество ядросодержащих клеток крови у интактных мышей CBF1ГруппаДоза 1/10 LD₅₀ (мг/кг)Кол-во ядросодержащих клеток% к контролюКонтроль 9,87×10⁶/мл Соединение7515,1*+52*достоверно, Р<0,05

Как видно из данных табл.1, соединение достоверно обладает миелостимулирующими свойствами, т.е. существенно более чем на 20% вызывает увеличение количества лейкоцитов (на 52%).

Пример 2. Оценка влияния соединения на первичный гуморальный ответ.

Опытной группе животных соединение вводили в дозе 1/10LD₅₀ внутрибрюшинно ежедневно в течение 7 дней в объеме 0,5 мл. Контрольным животным в таком же объеме и режиме вводили растворитель (воду). В день последнего введения соединения животных иммунизировали внутривенно эритроцитами барана (ЭБ) в дозе 0,5×10⁷/мышь. Количество IgМ АОК в селезенке мышей оценивали на 4-е сутки после иммунизации по количеству локальных зон гемолиза в полужидкой среде модифицированным методом (Cunningham, 1968). Результаты выражали в абсолютном количестве tgM AOK в селезенке.

Таблица 2
Влияние трис-(2-оксиэтил) аммониевой соли 2,4-дихлор-феноксиуксусной кислоты на абсолютное количество IgM-AOK в селезенке мышейГруппыЧисло lgМ-АОККонтроль1839Соединение4135**Р<0,05

Как видно из данных таблицы 2, соединение достоверно стимулирует первичный гуморальный иммунный ответ.

Пример 3. Оценка влияния соединения на клеточный иммунный ответ.

Опытной группе животных соединение вводили в дозе 1/10 LD₅₀ внутрибрюшинно ежедневно в течение 5 дней в объеме 0,5 мл. В день последнего введения соединения мышей сенсибилизировали внутрибрюшинным введением 0,25% ЭБ в объеме 0,5 мл; на 4-е сутки после сенсибилизации вводили разрешающую дозу антигена под подошвенный апоневроз правой задней лапы (50% ЭБ в объеме 50 мкл). В контрлатеральную лапу вводили растворитель в том же объеме. Контрольным животным в таком же объеме и режиме вводили растворитель соединения (воду). Реакцию ГЗТ оценивали по методике локальной ГЗТ (Crowte, 1975). Учет реакции производили через 24 часа после введения разрешающей дозы ЭБ, величину отека оценивали штангенциркулем. Результаты выражали в процентах или абсолютных значениях.

Таблица 3
Влияние трис-(2-оксиэтил)аммониевой соли 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты на реакцию гиперчувствительности замедленного типа (клеточный иммунитет)ГруппыГЗТ(%)1. Контроль47,72. Соединение35,2* ^*достоверно, Р<0,05

Как видно из данных Таблицы 3, трис-(2-оксиэтил)аммониевая соль 2,4-дихлор-феноксиуксусной кислоты достоверно подавляет клеточный иммунитет.

Пример 4. Оценка влияния соединения на спонтанную, Con А- и PWM-индуцированную пролиферацию клеток селезенки.

Клетки селезенки мышей культивировали в круглодонных планшетах для иммунологических реакций (“Linbro”) при +37°С в атмосфере 5% СО₂ и 95% воздуха. Абсолютное количество клеток, вносимых в лунку, составляло 200000. Клетки стимулировали митогенами - конканавалином А (Con A, Sigma) или митогеном лаконоса (PWM, Sigma). Концентрации митогенов подбирались предварительным титрованием и использовались в оптимальной дозе, что составило для Con А 2 мкг/мл, а для PWM - 1 мкг/мл. Соединение в трех дозах вносили в лунки одновременно с митогенами. Пролиферативную активность клеток оценивали по включению Н³-тимидина в ДНК делящихся клеток. Метку вносили за 16 час до конца культивирования по 1 мкКи в каждую лунку планшета. Для этого основной раствор Н³-тимидина сначала растворяли в среде RPMI-1640 до концентрации 100 мкКи/мл, а затем по 10 мкп раствора добавляли в каждую лунку планшета. По окончании инкубации клетки собирали на стеклянно-волокнистые фильтры ("Flow Lab") с помощью аппарата Harvester ("Tritertek"). Фильтры высушивали и помещали во флаконы для сцинтилляционного счета, и радиоактивность подсчитывали в толуольном сцинтилляторе (4 г дифенилоксазола, 0,1 г дифенил-оксазолилбензола на 1 л толуола) в жидкостном сцинтилляционном счетчике "Delta" (США). Результаты выражали в имп/мин включенного тимидина на 2×10⁵ клеток, представлены средние данные по триплету.

Таблица 4
Влияние трис-(2-оксиэтил) аммониевой соли 2,4-дихлор феноксиуксусной кислоты на спонтанную и митоген-стимулированную пролиферацию клеток селезенки интактных мышей in vitro (имп/мин)Доза соединения (мкг/мл)Спонтанная пролиферацияCon А-индуцированная пролиферация (2 мкг/мл)PWM-Индуцированная пролиферация (1 мкг/мл)Контроль33461507272260,7532261428566597,53566145435610*7526281144753465610* достоверно относительно соответствующего контроля, Р<0,05

Как видно из данных, соединение проявляет ингибирующие свойства на PWM-стимулированную пролиферацию интактных клеток селезенки мышей.

Оценивая в целом результаты, можно отметить, что по свойствам стимулировать лейкопоэз и первичный гуморальный ответ трис-(2-оксиэтил) аммониевая соль 2,4-дихлор феноксиуксусной кислоты может быть отнесена к иммуностимуляторам. А по свойствам подавлять клеточный иммунный ответ, спонтанную и стимулированную пролиферацию клеток in vitro - к иммунодепрессантам.

Приведенные примеры иллюстрируют наличие у трис-(2-оксиэтил) аммониевой соли 2,4-дихлор-феноксиуксусной кислоты иммуномодулирующих свойств, что позволит в будущем создавать на ее основе лекарственные средства для лечения различных иммунокомпрометированных состояний.

Предложено применение трис-(2-оксиэтил) аммониевой соли 2,4-дихлор феноксиуксусной кислоты в качестве иммуномодулятора. Вновь выявленные свойства позволяют создавать на ее основе лекарственные средства для лечения воспалительных, аутоиммунных и лимфопролиферативных заболеваний. Изобретение расширяет арсенал средств указанного назначения. 4 табл.

Применение трис-(2-оксиэтил) аммониевой соли 2,4-дихлор феноксиуксусной кислоты в качестве иммуномодулятора.