СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНДИВИДУАЛЬНОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ БОЛЬНОГО РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ К ЛЕВАМИЗОЛУ Российский патент 1994 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, в частности к ревматологии, и может быть использовано для лечения больных ревматоидным артритом (РА) путем выявления иммунологическим методом среди них лиц с хорошим прогнозом лечения иммуностимуляторами.

Целью предлагаемого изобретения является повышение информативности способа.

Способ выполняют следующим образом. Сначала выявляют вЕ-РОК изначально более 37,5, снижение его под действием левамизола на 4% и более, а также повышение активности спонтанных и индуцированных ФГА Тс под действием левамизола на 6; 5,5% и более соответственно. В случае, если по меньшей мере один из показаталей оказывается неинформативным, прогнозируют отрицательный эффект от назначения препарата. Но если неинформативным оказался показатель вЕ-РОК (изначальный и/или под действием левамизола), определяют активности Тс: спонтанных, индуцированных ФГА, гистамином и туберкулином.

Способы определения этих показаталей. Мононуклеарные клетки (МНК) периферической крови человека выделяют центрифугированием гепаринизированием венозной крови в градиенте плотности (1,077 г/мл) фикола-верографина. Собранные с интерфазы МНК трижды отмывают фосфат-забуференным физиологическим раствором (pH 7,2-7,3) и готовят клеточную суспензию в культуральной среде. Выход МНК в среднем составляет 1,2 ˙ 10⁶ клеток из 1 мл крови. Их разделяют на несколько проб. В одной из них определяют изначальное количество вЕ-РОК. Для этого свежие эритроциты барана (ЭБ) трехкратно отмывают в физиологическом растворе, далее готовят 1%-ную суспензию. Смесь ЭБ (0,2 мл) и МНК (0,2 мл 2,5 ˙10⁶ в мл) центрифугируют при 1000 об/мин 5 мин, инкубируют 90 мин при температуре 37^оС и затем 16-18 ч при 4^оС. Затем надосадок сливают, клетки ресуспендируют и подсчитывают процентное содержание вЕ-РОК. В других пробах определяют активности спонтанных и индуцированных ФГА, гистамином и туберкулином Тс. Культивирование клеток осуществляют в герметически закрытых стеклянных флаконах из-под пенициллина. Равные взвеси МНК (1 ˙ 10⁶ клеток/мл в среде 199 20%-ной сыворотки 4 группы) соответственно преинкубируют 24 ч, инкубируют туберкулином 8 мкг/мл 24 ч, гистамином 50 мкг/мл 24 ч, ФГА 10 мкг/мл 72 ч. Затем первичную культуру лимфоцитов обрабатывают 30 мин митомицином С. Затем лимфоциты трижды отмывают средой 199 и вносят в культуры аллогенных доноров при соотношении клеток 1:1. Вторичные культуры стимулируют ФГА 10 мкг/мл. Интенсивность пролиферации учитывают через 72 ч по включению Н^з-тимидина (удельная активность 15-20 Кю/моль) в нуклеопротеидные фракции клеток. Н³-тимидин добавляют за 4 ч до окончания культивирования в конечной концентрации 4 мкКю/мл на флакон. После окончания культивирования клетки отмывают однократно холодным фосфат-забуференным физиологическим раствором, инкубируют в течение ночи в 5%-ной (мас./об.) растворе трихлоруксусной кислоты. Нерастворимые фракции переносят на миллипоровые фильтры с диаметром пор 0,23 или 0,4 мкм, которые затем помещают в сцинтилляционные виалы. Радиоактивность экспериментального материала подсчитывают в сцинтилляционном счетчике SL-30. Параллельно в пробах МНК определяют чувствительность к левамизолу. Для этого предварительно МНК больных РА инкубируют с 1 мкг/мл левамизола (2,5 ˙10⁶ клеток в 1 мл среды 199 в течение 1,5 ч при 37^оС). Затем описанными методами определяют значения тех же показателей под действием левамизола, рассчитывают индекс нормализации супрессии.

Индекс нормализации супрессии рассчитывают по формуле:
ИНС = ( величина влияния левамизола ин витро на активность Тс₁/ нижняя граница норматива активности Тс₁ + величина влияния левамизола ин витро на активность Тс₂ /нижняя граница норматива активности Тс₂ + величина влияния левамизола ин витро на активн. Тс_п /нижняя граница норматива активности Тс_п)˙n, где n - количество субпопуляций Тс, достоверно увеличивающих свою активность под влиянием левамизола.

За нормативные значения содержания вЕ-РОК и показателей активности Тс принимают значения в пределах границ доверительного интервала показаталей у здоровых людей (М ± sts ˙ м, где М - математическое ожидание выборки; sts - стандартное значение критерия Стюдента для вероятности 99%; м - ошибка средней арифметической).

За величину влияния левамизола на иммунологические показатели ин витро принимают максимальную выборочную ошибку их средней арифметической и рассчитывают по формуле: М ˙ sts Стъюдента, где М - средняя ошибка показателя у здоровых людей.

Если рассчитанный описанным способом индекс нормализации супрессии составит более 4 единиц, прогнозируют целесообразность назначения левамизола.

В табл.1 представлены нормативные предельно допустимые значения показателей активности Тс, содержания вЕ-РОК и предельно допустимые величины влияния левамизола, превышение которых у больных расценивается как положительная нагрузочная проба, т.е. пациент является чувствительным к препарату.

П р и м е р 1. Больная Л., 38 лет, инвалид 2 группы. Клинический диагноз: классический ревматоидный артрит, серопозитивный, медленно прогрессирующее течение, активность II, рентгенологическая стадия III, НФ-11. Содержание вЕ-РОК 23% , изменение содержания под влиянием левамизола ин витро 30% . Активность неспецифических Тс: спонтанные О; индуцированные ФГА 13; гистамином 15; туберкулином 23. Изменение активности Тс под действием левамизола ин витро: спонтанные 18; индуцированные ФГА 26; гистамином 25; туберкулином 30.

Сравнительные полученные данные с нормативными свидетельствует о том, что содержание вЕ-РОК у больной снижено и под влиянием левамизола ин витро оно повысилось. Больной по способу-прототипу прогнозировали отрицательный эффект назначения левамизола.

Нормативные значения показаталей Т-системы иммунитета у здоровых людей и достоверные значения их изменения под действием левамизола ин витро даны в табл.1.

Определяем
ИНС = + + + 4 = 6,5 единиц, с учетом того, что под влиянием левамизола ин витро увеличились изначальные значения активности спонтанных Тс на 18%, индуцированных ФГА на 13%, гистамином на 10%, туберкулином на 7%. Исходя из табл.1 увеличение активности всех супрессоров под влиянием левамизола оказалось достоверным. Диагностический коэффициент (увеличение изначальных значений активности спонтанных и индуцированных ФГА Тс под действием левамизола ин витро + индекс нормализации супрессии) у этой больной равен 3+4,3+6 = 13,3 и следовательно назначение левамизола оправдано. Клинически был также положительный эффект в течение года приема левамизола по 150 мг 1 раз в неделю.

П р и м е р 2. Больная С. 41 год, экономист. Клинический диагноз: классический ревматоидный артрит, серопозитивный, активность I, рентгенологическая стадия III, НФ-II.

Содержание вЕ-РОК 67%, изменение содержания под действием левамизола ин витро 65%. Активность неспецифических Тс: спонтанные 11; индуцированные ФГА 0; туберкулином 23; гистамином 17.

Изменение активности Тс под влиянием левамизола ин витро: спонтанные 21; индуцированные ФГА 10; туберкулином 30; гистамином 26. Сравнение полученных значений с нормативами свидетельствует о том, что содержание вЕ-РОК у больной повышено, но под влиянием левамизола ин витро не произошло его существенного снижения, по способу-прототипу больной прогнозируется отрицательный эффект назначения левамизола. Определяем ИНС, он равен + + + 4 = 5,1 . Следовательно, сумма диагностических коэффициентов у данной больной (повышение содержания вЕ-РОК больше 37,5% + увеличение изначальных значений активности спонтанных и индуцированных ФГА Тс на 6% и 5,5% соответственно + индекс нормализации супрессии более 4 единиц) равна (3+3+4,3+6) = 16,3. Отсюда вероятность положительного клинического эффекта у больной составляет 98% и назначение левамизола оправдано. Больной назначен декарис по 150 мг 1 раз в неделю, который, начиная с 3-го месяца, привел к уменьшению выраженности суставного синдрома, снижению активности воспалительного процесса, сохранившемуся в течение года лечения.

Пределы числовых значений параметров определяются точностью аппаратуры, пригодной для медицинских целей.

Обоснование достоверности способа и параметров исследуемых показателей.

Обследована 51 больная с классическим и определенным РА в возрасте 19-44 года, давностью заболевания от 1 года до 12 лет. Клиническая характеристика больных РА до начала лечения показана в табл.2.

Влияние левамизола на исследуемые показатели показано в табл.3.

Все больные получали левамизол венгерского производства под фирменным названием декарис по 150 мг раз в неделю в течение года. Препарат назначали на фоне длительно проводимой ранее терапии нестероидными противовоспалительными средствами и глюкокортикоидами. Эффективность лечения оценивали по достоверно значимым величинам изменения следующих клинических показателей:
время утренней скованности 0,15 балла;
сила сжатия кисти 10 мм рт.ст.;
окружность проксимальных межфаланговых суставов 3 мм;
суставной счет 1,3 балла;
функциональный тест 1,2 балла;
суставной индекс 2,4 балла;
СОЭ 5 мм/ч.

Кроме этих показателей, при оценке эффективности лечения учитывали восьмой признак - уменьшение дозы нестероидных противовоспалительных средств на 50% и полную отмену стероидных препаратов.

Под улучшением понимали достоверно значимую, положительную динамику 6 из 8 указанных признаков, при отсутствии отрицательной динамики хотя бы одного из оставшихся двух критериев. Под ухудшением понимали отрицательную динамику 1-3 и более показаталей. К концу наблюдения (через год после лечения) из 51 больной РА положительный эффект был отмечен у 18, отсутствие эффекта у 10 больных, осложнения от терапии левамизолом развились у 23 больных. В этих случаях на разных сроках наблюдения препарат был отменен.

В табл. 4 представлены данные о различиях в клинических показателях в обеих подгруппах через год после лечения левамизолом. Из нее следует, что в подгруппе больных с положительным эффектом от лечения отмечается положительная динамика к концу наблюдения всех клинических признаков, тогда как в другой подгруппе они не изменились или имели отрицательную динамику. В то время как до начала лечения больные в этих подгруппах существенно не отличались друг от друга.

Прогноз эффекта по иммунологическим показателям приведен в табл.6.

Для оценки точности прогноза для каждого признака были высчитаны диагностические коэффициенты и информативность (вклад данного признака в приближение к правильному диагностическому порогу). Основу расчетов составили вероятностные методы распознавания образов. Диагностический коэффициент (ДК) признака рассчитывали по модифицированной формуле Кульбака. Информативность признака рассчитывали по формуле: j = ДК ˙ 0,5 (частость признака Ат - частота признака А₂). В случае, если выявляют изначальное содержание вЕ-РОК ниже 37,5% или его снижение под действием левамизола ин витро менее чем на 4%, то ошибка прогноза отрицательного эффекта снижается до 2%, а точность положительного прогноза соответственно повышается до 98%, так как суммарный диагностический коэффициент в этом случае составляет 16,3.

В случае, если выявляют изначальное содержание вЕ-РОК ниже 37,5% и его снижение под действием левамизола ин витро менее чем на 4%, то ошибка прогноза отрицательного эффекта снижается до 5%, а точность положительного прогноза соответственно повышается до 95%, так как суммарный диагностический коэффициент в этом случае составляет 13,3.

На основании расчета диагностических коэффициентов и информативности иммунологических показателей предлагается для практического применения прогностическая таблица у каждого конкретного больного после иммунологического обследования с использованием прогностических критериев, решается вопрос о возможности назначения левамизола.

Изобретение относится к медицине, а именно к ревматологии, и может быть использовано для лечения больных ревматоидным артритом. Целью изобретения является повышение информативности способа. Для этого выявляют больных с содержанием в их периферической крови восстановленных Е-РОК 37,5% и менее и/или под действием левамизола снижением этого показателя менее, чем на 4%, повышенной активностью под действием левамизола спонтанных и индуцированных ФГА Т-супрессоров соответственно не менее, чем на 6% и 5,5%, дополнительно определяют у них активность Т-супрессоров, индуцированных гистамином и туберкулином, после чего определяют индекс нормализации супрессии ИНС = [(Тс.сп. Л. /Тс.Сп.н.) + (Тс.ФГА.Л./Тс.ФГА.н.) + (Тс.Т.Л./Тс.Т.н.) + (Тс.Г.Л./Тс.Г.н. )] 4, где Тс.сп.Л., Тс.ФГА.Л., Тс.Т.Л., Тс.Г.Л. - величина влияния левамизола на соответствующую субпопуляцию Т-лимфоцитов; Тс.сп.н, Тс.ФГА.н, Тс.Т.н., Тс. Г.н. - нижняя граница норматива активности соответствующей популяции Т-лимфоцитов. При ИНС более 4 единиц прогнозируют положительный клинический эффект применения левамизола. 6 табл.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНДИВИДУАЛЬНОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ БОЛЬНОГО РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ К ЛЕВАМИЗОЛУ путем выявления до и после воздействия левамизола in vitro на периферическую кровь, количества восстановительных розеткообразующих клеток, активности спонтанных и индуцированных ФГА Т-супрессоров, отличающийся тем, что, с целью повышения информативности способа, дополнительно пробы мононуклеаров преинкубируют 24 ч при 37^oС и инкубируют 24 ч с туберкулином и гистамином, и выявляют активность Т-супрессоров, далее высчитывают индекс нормализации супрессии (ИНС) по формуле
ИНС= + + + ,
где T_с.сп.н. - количество Т-спонтанных супрессоров в норме;
T_с.сп.л. - количество Т-спонтанных супрессоров после воздействия левамизола;
T_{с.ФГА.л.} - активность Т-супрессоров, индуцированных ФГА, после воздействия левамизола;
T_с.т.л. - активность Т-супрессоров, индуцированных туберкулином, после воздействия левамизола;
T_с.г.л. - активность Т-супрессоров, индуцированных гистамином, после воздействия левамизола;
T_{с.ФГА.н.} - активность Т-супрессоров, индуцированных ФГА, в норме;
T_с.т.н. - активность Т-супрессоров, индуцированных туберкулином, в норме;
T_с.г.н. - активность Т-супрессоров, индуцированных гистамином, в норме,
и при наличии количества восстановленных розеткообразующих клеток до воздействия левамизола 37,5% и менее, снижении их под действием левамизола менее чем на 4%, повышении активности спонтанных и индуцированных ФГА-супрессоров не менее чем на 5,5 - 6% и индексе нормализации супрессии более 4 единиц определяют организм чувствительным к левамизолу.