СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВЛИЯНИЯ СО*002 НА ГЕНЕРАЦИЮ СУПЕРОКСИДНОГО АНИОН-РАДИКАЛА ФАГОЦИТАМИ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/48 G01N33/52 

Изобретение относится к медицине и касается исследования влияния CO₂ на генерацию супероксидного анионрадикала фагоцитами. Важность способа: определение влияния CO₂ на генерацию супероксидного анион-радикала фагоцитами представляет как общебиологический интерес, поскольку CO₂ постоянно образуется во всех клетках и тканях и важно знать его модулирующее влияние на генерацию супероксидного анион-радикала, так и общеэкологический интерес в связи с нарастанием общей концентрации CO₂ в атмосфере и грозящим "парниковым эффектом. Данные изобретения должны рассматриваться в качестве пионерского.

Цель изобретения - разработка способа.

Поставленная цель достигается тем, что производят забор крови у человека, выделяют фагоциты, воздействуют газовой смесью с повышенным содержанием CO₂ в течение 45-60 мин, помещают анализируемую пробу в спектрофотометр, измеряют оптическую плотность и сравнивают влияние воздействия на фагоциты газовой смесью с нормальным содержанием CO₂.

Способ осуществляется следующим образом.

Лейкоциты выделяли из 8-10 мл гепаринизированной крови донора, полученной из кубитальной вены. Отстаиванием крови в течение 1,5 - 2,0 ч при 4^oC и/или центрифугированием при 500 об/мин /60g/ 7-10 мин вызывали ее расслоение на верхний плазменный слой, содержащий тромбоциты и частично лейкоциты, нижний слой - эритроцитарный и промежуточный в виде белосоватой лейкоцитарной пленки. Лейкоцитарную пленку и часть плазмы переносят с центрифужную конусообразную пробирку и освобождают от примеси эритроцитов посредством осмолизиса с помощью дисстиллированной воды в течение 10 с, восстанавливают изоосмолярность путем добавлением 3,6% раствора натрия хлорида из расчета 1 мл на 3 мл воды, снова центрифугируют при 1000 об/мин /200 g/ 10 мин. Образующийся осадок отмывают физиологическим /0,0%/ раствором натрия хлорида, pH 7,35. Объем полученной лейкомассы доводили до 1 мл добавлением забуференного физиологического раствора натрия хлорида /ЗБФР/, pH 7,35, состоящего из 7,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида и 2,5 мл фосфатно-щелочного буфера с pH 7,35. подсчитывали концентрацию лейкоцитов в лейкомассе и доводили ее обычно до 5000 клеток в 1 мкл. генерацию супероксидного анионрадикала /САР/ лейкоцитами определяли в реакции с нитроблаутетразолием /НБТ/. НБТ, вступая в химическую реакцию с САР, восстанавливается восстанавливается в формазаны, которые экстрагируются смесью ДМСО и хлороформа /2:1/ и измеряется их концентрация спектрофотометрически -λ = 560 нм. Реакция проводится при контакте лейкоцитов, взвешенных в ЗБФР с опсонизированным зимозаном в присутствии супероксиддисмутазы и при замене ее в контроле на равное количество альбумина. По разности концентрации формазанов в контроле и в присутствии супероксиддисмутазы судили об их концентрации образовавшихся только под влиянием САР.

Инкубационная система состояла из 0,3 мл взвеси лейкоцитов в ЗБФР /5000 в 1 мкл; общее количество 1,5•10⁶/ + 0,3 мл опсонизированного зимозана + 250 мкг супероксиддисмутазы в 0.2 мл ЗБФР + 0,3 мл 0,2% раствора НБТ; в контроле 1 были те же ингредиенты, но вместо супероксиддисмутазы вводили равное количество, альбумина в равном объеме; в контроле ингредиенты были те же, но минус супероксиддисмутаза - и альбумин - вместо них для выравнивания объема добавляли 0,4 мл ЗБФР. Инкубационные пробы помещали в минибарокамеру, находившуюся в термостате при 36,9^oC. Под контролем манометра откачивали воздух на 67,5 мм рт. ст (т.е. до 692,5 мм рт. ст) и вводили CO₂ (+37,5 мм рт. ст), повышая общее давление до 730 мм рт. ст. При этом в барокамере сохранялось разрежение равное 30 мм рт. ст, необходимое для обеспечения ее герметичности. Таким образом в минибарокамере создавалась газовая смесь: воздух -P= 692,5 мм рт.ст. 94,9% + CO₂-P = 37,5 мм рт.ст. /5,1%/. По аналогичной технологии готовили и остальные газовые смеси: воздух - P = 671,6 мм рт.ст. /92%/ + CO₂-P = 58,4 мм рт. ст. /8%; воздух- P = 584 мм рт.ст. /80%/ + CO₂-P = 146 мм рт. ст. /20%/. Общее P газовой смеси 730 мм рт.ст. Для контроля в минибарокамеру точно также как в основных опытах помещали лейкоцитарные пробы с pH 7,35 и точно также под контролем манометра, на такие же величины P откачивали воздух, однако вместо CO₂ опять вводили воздух на величину, равную PCO₂ основных опытах /соответственно на 37,5, 58,4, 146 мм рт.ст/ Опытные и контрольные пробы инкубировали 45-60 мин. После окончания инкубации извлекали из барокамеры опытные и контрольные пробы. Останавливали реакцию добавлением 5NHCl. Экстрагировали продукты реакции формазаны и измеряли их концентрацию по оптической плотности λ = 560 нм. Вычитали из оптической плотности опыта и контроля 1 оптическую плотность в контроле 2, характеризовавшую образование формазанов в покое и под влиянием имеющихся в лейкоцитах диафораз и дегидрогеназ. Далее от величины оптической плотности в контроле 1, где образовался формазан как под влиянием CAP, так и под влиянием диафораз и дегидрогеназ - при стимуляции зимозаном, вычитали величину оптической плотности в опыте, где формазаны образовались только за счет диафораз и других ферментов. Разность показывает величину оптической плотности формазанов, образовавшихся только под влиянием САР. Рассчитывали коэффициент ингибирующего влияния CO₂ путем деления конечной разности НБТ-реакции в воздухе на аналогичную в газовой смеси воздух + CO₂.

Пример 1. У мужчины, 26 лет 1-й группы крови, взята кровь, выделена лейкомасса. Инкубационные системы опыта, которые состояли из: 1) 0,3 мл взвеси лейкоцитов в ЗБФР + 0,3 мл зимозана + 0,2 мл супероксиддисмутаза + 0,3 мл НБТ; 2) те же ингредиенты, но вместо супероксиддисмутазы альбумин; 3) те же ингредиенты, но вместо супероксиддисмутазы и альбумина ЗБФР, помещали в минибарокамеру и под контролем монометра откачивали воздух на 67,5 мм рт.ст. (т.е. до 692,5 мм рт.ст.) и вводили CO₂ (+ 37,5 мм рт.ст), повышая общее давление до 730 мм рт.ст. т.е. воздействовали 5,1% CO₂, выдерживали 45 мин, вынимали и измеряли оптическую плотность, которая составила: система 1 - 0,163 ЕОП: 2 - 0,288; 3 - 0,085 ЕОП. Таким образом, количество формазанов, образовавшихся в реакции лейкоцитов с НБТ после воздействия 5,1% CO₂ составило 0,150 ЕОП. Для контроля в минибарокамеру точно также как в основных опытах помещали аналогичные икубационные системы и точно также под контролем манометра на такие же величины P откачивали воздух, однако вместо CO₂ опять вводили воздух на величину, равную PCO₂ основных опытах /37,5 мм рт.ст./, выдерживали 45 мин, вынимали и измеряли оптическую плотность, которая составила: система 1 - 0,172 ЕОП; 2 - 0,322 ЕОП; 3 - 0,090 ЕОП. Таким образом, количество формазанов образовавшихся в реакции лейкоцитов с НБТ, составило 0,150 ЕОП. Таким образом, 5,1 % CO₂ снизило генерацию САР лейкоцитами в 1,2 раза.

Пример 2. У женщины, 27 лет, 2-й группы крови, взята кровь, выделена лейкомасса. Инкубационные системы которые состояли из: 1) 0,3 л взвеси лейкоцитов в ЗБФР + 0,3 мл зимозана + 0,2 мл супероксиддисмутазы + 0,3 мл НБТ; 2) те же ингредиенты, но вместо супероксиддисмутазы альбумин; 3) те же ингредиенты, но вместо супероксиддисмутазы и альбумина ЗБФР, помещали в минибарокамеру и под контролем монометра откачивали воздух на 88,4 мм рт.ст. /т.е. до 671,6 мм рт.ст/ и вводили CO₂/+ 58,4 мм рт.ст./, повышая общее давление до 730 мм рт.ст., т.е. воздействовали 8% CO₂, выдерживали 45 мин, вынимали и измеряли оптическую плотность, которая составила: система 1 - 0,199 ЕОП; 2 - 0,536 ЕОП; 3 - 0,070 ЕОП. Таким образом, количество формазанов, образовавшихся в реакции лейкоцитов с НБТ после воздействия 8% CO₂, составило 0,337 ЕОП. Для контроля в минибарокамеру точно также, как в основных опытах, помещали аналогичные инкубационные системы и точно также под контролем монометра на такие же величины P откачивали воздух, однако вместо CO₂ опять вводили воздух на величину, равную PCO₂ основных опытах /58,4 мм рт.ст./, выдерживали 45 мин, вынимали и измеряли оптическую плотность, которая составила: система 1 - 0,301 ЕОП; 2 - 0,869 ЕОП; 3 - 0,112 ЕОП. Таким образом, количество формазанов, образовавшихся в реакции лейкоцитов с НБТ, составило 0,568 ЕОП. Следовательно 8% CO₂ снизил генерацию САР лейкоцитами в 1,69 раз.

Пример 3. У женщины, 28 лет, 2-й группы крови, взята кровь, выделена лейкомасса. Инкубационные системы которые состояли из: 1) 0,3 мл взвеси лейкоцитов в ЗБФР + 0,3 мл зимозана + 0,2 мл супероксиддисмутазы + 0,3 мл НБТ; 2) те же ингредиенты, но вместо супероксиддисмутазы альбумин; 3) те же ингредиенты, но вместо супероксиддисмутазы и альбумина ЗБФР, помещали с минибарокамеру и под контролем монометра откачивали воздух на 176 мм рт.ст. (т.е. до 584 мм рт.ст.) и вводили CO₂ (+ 146 мм рт.ст), повышая общее давление до 730 мм рт.ст., т.е. воздействовали 20% CO₂, выдерживали 45 мин, вынимали и измеряли оптическую плотность, которая составила: система 1 - 0,120 ЕОП; 2 - 0,173 ЕОП; 3 - 0,078 ЕОП. Таким образом, количество формазанов, образовавшихся в реакции лейкоцитов с НБТ после воздействия 20% CO₂, составило 0,040 ЕОП. Для контроля в минибарокамеру точно также как в основных опытах помещали аналогичные инкубационные системы и точно также под контролем монометра, на такие же величины P откачивали воздух, однако вместо CO₂ опять вводили воздух на величину, равную PCO₂ основных опытах /146 мм рт.ст.), выдерживали 45 мин, вынимали и измеряли оптическую плотность которая составила: система 1- 0,297 ЕОП; 2 - 0,768 ЕОП; 3 - 0,093 ЕОП. Таким образом, количество формазанов, образовавшихся в реакции лейкоцитов с НБТ, составило 0,471 ЕОП. Следовательно 20% CO₂ снизил генерацию САР лейкоцитами в 8,89 раз.

Предложенный способ готов к использованию. Способ осуществляется в течение 2 ч с момента забора крови.

Способ поясняется таблицей.

Использование: медицина, для определения влияния СО₂ на генерацию супероксидного анион-радикала фагоцитами. Сущность изобретения: из крови человека выделяют фагоциты, воздействуют на них газовой смесью с повышенным содержанием СО₂ в течение 45-60 мин, помещают анализируемую пробу в спектрофотометр, измеряют оптическую плотность и сравнивают с влиянием воздействия на фагоциты газовой смеси с нормальным содержанием СО₂. 1 табл.

Способ определения влияния СО₂ на генерацию супероксидного анион-радикала фагоцитами, включающий забор крови у человека, выделение фагоцитов, воздействие на них газовой смесью, содержащей СО₂, с напряжением, близким таковому в артериальной крови и более, в течение 45 - 60 мин, помещение анализируемой пробы в спектрофотометр, измерение оптической плотности и сравнение влияния воздействия на фагоциты газовой смесью с содержанием СО₂, равным таковому в воздухе.