Способ определения супероксидного анион-радикала при фагоцитозе Советский патент 1992 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, в частности к биохимии, и касается способа оценки интенсивности свободно-радикальных процессов в крови.

Цель изобретения - повышение чувствительности, точности способа и сокращение времени исследования.

Способ осуществляется следующим образом.

У донора берут 8-10 мл венозной крови (в пробирку с гепарином из расчета 10 мкл гепарина на 1 мл крови). Выделяют лейкоциты отстаиванием в пробирке в течение 1,5-2 ч или центрифугированием ее при 500 об/мин 5-7 мин; при этом кровь расслаивается на три слоя: нижний эритроцитар- ный - красного цвета, средний лейкоцитарный-в виде тонкой белесоватой пленки и верхний - плазменный; отсасывают средний слой (лейкоцитарный) и большую часть верхнего плазменного слоя и

переносят в центрифужную пробирку; центрифугируют при 1000 об/мин 10 мин. Образовавшийся осадок - это лейкоциты. Освобождают лейкоциты от примеси эритроцитов посредством мягкого осмоли- зиса - добавлением 6 мл дистиллированной воды на 10 с и остановкой его восстановлением изоосмолярности добавлением 2 мл гипертонического (3,6%) раствора поваренной соли. Центрифугируют при 1000 об/мин, отбрасывают супернатант; осадок, состоящий из лейкоцитов, дважды отмывают 6-8 мл физиологического раствора (рН - 7,35), разводят полученную лейкоцитарную взвесь физиологическим раствором (рН- 7,35) до конечной концентрации лейкоцитов 3x10 а 1 мкл. Затем 0,2 мл лейкоцитарной взвеси переносят в пробирку, добавляют0,5 мл 0,2%-ного раствора нитросинего.тетра- зония (НСТ)и 0,2 мл раствора, содержащего опсонизированные плазмой частицы зимоVIСА СЛ VI 00

4

зана из расчета 70-100 частиц зимозана на 1 лейкоцит. Смесь инкубируют в термостате при температуре 38,5-39,0°С в течение 1- 1,5 ч. После этого добавляют в пробирку 1 мл 5 М раствора соляной кислоты (для оста- новки реакции), центрифугируют смесь при 3000 об/мин в течение 10 мин, супернатант удаляют. Осадок, состоящий из продуктов реакции взаимодействия супероксидного ариона - радикала (САР) и НСТ - формаза- нов, экстрагируют 3 мл раствора, содержащего 2 мл диметилсульфоксида и 1 мл хлороформа в течение 15 мин при . Затем повторно центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин и вновь проводят экстракцию. После этого проводят спектро- фотометрию каждого экстракта при длине волны 560 нм. Контролем служит смесь диметилсульфоксида (ДМСО) и хлороформа в соотношении 2:1. Результаты измерений двух экстрактов суммируются: вместе они показывают концентрацию САР по оптической плотности продуктов реакции взаимодействия САР с НСТ-формазанов в единицах оптической плотности (ЕОП).

Пример.У донора берут 8-10 мл крови (мужчина 21 года, группа крови 0/1). К 0,2 мл взвеси лейкоцитов (концентрация 3000 в 1 мкл) добавляют 0,5 мл 0,2%-ного раствора НСТ и 0,2 мл опсонизированного зимозана (из расчета 70-100 частиц зимозана на 1 лейкоцит). Смесь инкубируют в термостате при температуре 38,5°С в течение 1,5 ч. После этого для остановки реакции добавляют 1 мл 5 М раствора соляной кис- лоты. Сразу же дважды экстрагируют гранулы образовавшегося осадка формазанов - смесью ДМСО с хлороформом в соотношении 2:1 при 55°С, каждый раз по 15 мин. Затем проводили спектрофотометрию каж- дого экстракта при длине волны 560 нм. В качестве контроля использовали смесь ДМСО с хлороформом в соотношении 2:1. Данные спектрофотометрических измерений двух экстрактов суммировали. Суммар- ная величина показывала концентрацию САР по оптической плотности продуктов реакции САР и НСТ-формазанов. Результат: 0,248 единиц оптической плотности; (0,193+ 0,055 ВОП), общее время проведения исс- ледования 3 ч.

П р и м е р 2. Кровь того же донора. К 0,2 мл взвеси лейкоцитов (3000 в 1 мкл) добавили 0,5 мл 0,2%-ного раствора НСТ и 0,2 мл взвеси опсонированного зимозана (из расчета 70-100 частиц на 1 лейкоцит), Инкубировали смесь в термостате при температуре 39,0°С в течение 1,5 ч. Для остановки реакции добавили 1 мл 5 М раствора соляной кислоты. Сразу же после этого образовавшийся осадок гранул формазанов (продукты реакции САР и НСТ) дважды экстрагировали смесью ДМСО с хлороформом в соотношении 2:1 при 55°С, каждый раз по 15 мин. Затем проводили спектрофотометрию каждого экстракта при длине вол- ны 560 нм. В качестве контроля использовалась смесь ДМСО с хлороформом в соотношении 2:1. Данные спектрофо- тометрий двух экстрактов суммировали. Суммарная величина показывала концентрацию САР по оптической плотности продуктов реакции САР и НСТ-формазанов в ЕОП. Результат 0,245 единиц оптической плотности; общее время проведения исследования 3 ч (0,205 + 0,040 ВОП).

В заключении следует отметить, что предлагаемый способ выгодно отличается от известного тем, что его выполнение требует в 4 раза меньше времени (около 3 ч), чем по известному (12-14 ч), повышает чувствительность в среднем на 55% (количество образующегося САР по концентрации конечного продукта реакции САР и НСТ- формазанов по предлагаемому способу составляет в среднем 0,245 ЕОП, а по известному 0,1575, уменьшает разброс результатов исследования (количество образующегося САР по концентрации формазанов ъ в 10 раз) по предлагаемому способу-0,243- 6,248 ЕОП, А 0,005; по известному 0,122- 0,172 ЕОП, А 0,05, повышает точность исследования (по предлагаемому способу средняя ошибка m равна 0,00084, по известному-0,01284).

Формула изобретения Способ определения супероксидного анион-радикала при фагоцитозе, включающий забор крови, выделение лейкоцитов, инкубацию их с опсонизированными частицами зимозана и нитросиним тетразолием, добавление соляной кислоты, экстракцию органическим растворителем и определение содержания супероксидного анион-радикала по оптической плотности экстракта с помощью спектрофотометра, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности, точности способа и сокращения времени анализа, лейкоциты инкубируют с опсочизированными частицами зимозана при 38,5-39,0°С, для остановки реакции используют 5 М раствор соляной кислоты, в качестве органического растворителя используют смесь диметилсульфоксида и хлороформа, взятых в соотношении 2:1, перед спектрофотометрией экстракцию растворителем проводят при 55-59°С.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения супероксидного анион-радикала при фагоцитозе. Цель изобретения - повышение чувствительности, точности способа и сокращение времени анализа. У обследуемого берут кровь, выделяют лейкоциты, инкубируют в присутствии нитросинего тет- разолия и опсонированными плазмой частицами зимозана при 38,5-39,0°С. Реакцию останавливают 5 М соляной кислотой, затем проводят центрифугирование и осадок экстрагируют смесью диметилсуль- фоксида и хлороформа, взятых в соотноше- нии 2:1, при 55-59°С с последующим определением супероксидного анион-радикала спектрофотометрически. По сравнению с прототипом чувствительность способа возрастает на 55%, точность в 10 раз при сокращении времени анализа в 4 раза. Ј