СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУПЕРОКСИДНОЙ АКТИВНОСТИ ВЫДЫХАЕМОГО ВОЗДУХА У БОЛЬНЫХ И ЗДОРОВЫХ ЛЮДЕЙ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/497 G01N33/50 

Изобретение относится к медицине, в частности к патофизиологии, пульмонологии и биохимии.

Известен способ определения продуктов перекисного окисления липидов в выдыхаемом воздухе этана и пентана, образующихся при распаде окисленных жирных кислот [1], который позволяет судить об интенсивности липидных свободнорадикальных реакций в дыхательной системе и может считаться аналогом данного изобретения. Этот способ однако не пригоден для оценки супероксидной активности выдыхаемого воздуха (активности супероксидного анион-радикала - САР). Прототип изобретения отсутствует.

Технической задачей изобретения является разработка метода определения супероксидной активности выдыхаемого воздуха больных и здоровых людей.

Задача достигается путем собирания выдыхаемого воздуха в полиэтиленовый мешок, соединенный с клапаном и нагубником, позволяющими свободно вдыхать атмосферный воздух и выдыхать воздух из легких в полиэтиленовый мешок, инкубации специально подготовленной тест-системы в газовой камере с испытуемым воздухом и последующего спектрофотометрического измерения концентрации формазана (продукт взаимодействия САР исследуемого воздуха и НСТ- нитросинего тетразолия).

У исследуемого человека (больного или здорового) с помощью нагубника с дыхательным клапаном собирают выдыхаемый воздух в герметичный полиэтиленовый мешок объемом 6 литров. Клапан устроен так, что позволяет свободно вдыхать воздух из окружающей среды и выдыхать воздух из легких в полиэтиленовый мешок.

В газовую камеру помещают тест-систему, состоящую из следующих компонентов:
1. 0,3 мл буферной смеси (БС).

2. 0,3 мл 0,2% раствора нитросинего тетразолия (НСТ) в БС.

3. 250 мкг супероксиддисмутазы (СОД) в 0,2 мл БС.

Подготовку тест-системы проводят в пробирке диаметром 1 см и длиной 5-6 см. В каждом исследовании параллельно с опытной пробой готовят контрольную, отличающуюся от опытной только заменой СОД на альбумин в разном количестве и равном объеме БС.

Из газовой камеры откачивают воздух до 310 мм рт. ст. (то есть разрежают воздух в ней на 450 мм) и вводят в камеру испытуемый воздух человека (больного или здорового) до общего давления 730 мм рт. ст., таким образом испытуемый воздух всегда занимает стандартный объем в камере. Остающееся относительно небольшое разрежение в камере, равное 30 мм рт. ст., необходимо для ее герметизации.

Опытную и контрольную пробу инкубируют в газовой камере с испытуемым воздухом 40-60 мин, после чего останавливают реакцию добавлением 0,5 мл 5М соляной кислоты. Пробы центрифугируют при 3000 об/мин 10 минут. Затем супернатант отбирают и измеряют в нем (спектрофотометр, длина волны 560 нм) оптическую плотность мелкодисперсного окрашенного продукта взаимодействия САР и НСТ - формазана. Из осадка экстрагируют смесью диметилсульфоксид-хлороформ (2: 1) крупнодисперсную фракцию (гранулы) формазана и также измеряют оптическую плотность экстракта. Все измерения проводят против смеси диметилсульфоксид-хлороформ. Результаты измерения оптической плотности супернатанта и экстракта из осадка суммируют раздельно в опытной пробе (инкубация с СОД) и контрольной пробе (инкубация с альбумином). Разность между оптическими плотностями контрольной и опытной проб соответствует содержанию САР в единицах оптической плотности (ЕОП) продукта реакции - формазана. По разности (абсолютной и в процентах) между содержанием САР в воздухе больного и здорового человека судят о супероксидной активности выдыхаемого воздуха исследуемых людей.

Возможно также проведение определения активности САР в загрязненном атмосферном воздухе окружающей среды и для контроля - в условно нормальном атмосферном воздухе.

Пример. У исследуемого больного с помощью нагубника с дыхательным клапаном собирают выдыхаемый воздух в герметичный полиэтиленовый мешок объемом 6 литров. Клапан устроен так, что позволяет свободно вдыхать воздух из окружающей среды и выдыхать воздух из легких в полиэтиленовый мешок. В газовую камеру помещают тест-систему, состоящую из следующих компонентов:
1. 0,3 мл БС.

2. 0,3 мл НСТ и БС.

3. 250 мкг СОД в 0,2 мл БС.

Подготовку тест-системы проводят в пробирке диаметром 1 см и длиной 5-6 см. В каждом исследовании параллельно с опытной пробой готовят контрольную, отличающуюся от опытной только заменой СОД на альбумин в равном количестве и равном объеме БС. Из газовой камеры откачивают воздух до 310 мм рт. ст. (то есть разрежают воздух в ней на 450 мм ) и вводят в камеру испытуемый воздух человека (больного или здорового) до общего давления 730 мм рт. ст. Остающееся относительно небольшое разрежение в камере, равное 30 мм рт. ст., необходимо для ее герметизации. Опытную и контрольную пробы инкубируют в газовой камере с испытуемым воздухом 60 мин при 36,9^oC, после чего останавливают реакцию добавлением 0,5 мл 5М соляной кислоты. Пробы центрифугируют при 3000 об/мин 10 минут. Затем супернатант отбирают и измеряют в нем (спектрофотометр, длина волны 560 нм) оптическую плотность мелкодисперсного окрашенного продукта взаимодействия САР и НСТ-формазана. Из осадка экстрагируют смесью диметилсульфоксид-хлороформ (2: 1) крупнодисперсиную фракцию (гранулы) формазана и также измеряют оптическую плотность экстракта. Все измерения проводят против смеси диметилсульфоксид-хлороформ. Результаты измерения оптической плотности супернатанта и экстракта из осадка суммируют раздельно в опытной пробе (инкубация с СОД) и контрольной пробе (инкубация с альбумином). Разность между оптическими плотностями контрольной и опытной проб соответствует содержанию САР в единицах оптической плотности (ЕОП) продукта реакции - формазана.

В данном конкретном опыте разность между показателями оптической плотности опытной (СОД) и контрольной (альбумин) пробами исследованного в стандартном объеме воздуха составила: содержание САР в выдыхаемом воздухе больного бронхиальной астмой человека равно 0,100 (ЕОП) фармазана, средняя величина содержания САР в воздухе контрольных практически здоровых людей (11 человек) равна 0,070 (ЕОП) фармазана. Разность 0,100 - 0,070 = 0,030 (ЕОП) характеризует изменение (нарастание) супероксидной активности в выдыхаемом воздухе исследуемого больного.

Предлагаемый способ является уникальным, не имеющим соответствующего прототипа. Он неинвазивен, позволяет проводить прижизненное физиологическое наблюдение за человеком, находящимся в различных функциональных состояниях, в том числе экстремальных. Область применения данного способа: для изучения патогенеза, для диагностики и контроля лечения внутренних, хирургических и др. болезней у людей, а также для оценки качества атмосферного воздуха окружающей среды и помещений.

Используемая литература
1. A.L. Tappel, Cora J. Dillard. - In vito lipid peroxydation: measurement via exhaled pentane and prontection by vitamin E. Federat. Pros. 1981, v. 40, 174-178.

Изобретение может быть использовано в медицине, а именно в патофизиологии, пульмонологии и биохимии. Получают выдыхаемый воздух испытуемого, инкубируют стандартный объем исследуемого воздуха с нитросиним тетразолием в присутствии супероксиддисмутазы (СОД), а для контроля - с альбумином, экстрагируют смесью диметилсульфоксид хлороформ продукты взаимодействия супероксидного aниoн-радикала и нитросинего тетразолия - формазанов, спектрофотометрически определяют концентрацию формазанов по оптической плотности. Насчитывают концентрацию формазанов и оценивают по ней активность супероксидного анион-радикала (CAP). По разности (абсолютной и в процентах) между содержанием CAP в исследуемом воздухе пациента и здорового человека судят об изменении супероксидной активности воздуха исследуемых людей. Способ обеспечивает точность и неинвазивность исследования.

Способ определения супероксидной активности выдыхаемого воздуха у больных и здоровых людей, заключающийся в том, что у исследуемого человека с помощью нагубника с дыхательным клапаном собирают выдыхаемый воздух в герметичный полиэтиленовый мешок, инкубируют стандартный объем испытуемого воздуха с нитросиним тетразолием в присутствии супероксиддисмутазы и для контроля - с альбумином, экстрагируют смесью диметилсульфоксид - хлороформ продукты взаимодействия супероксидного анионрадикала и нитросинего тетразолия - формазаны, спектрофотометрически определяют их оптическую плотность, рассчитывают концентрацию формазанов на стандартный объем испытуемого выдыхаемого воздуха, вычисляют и оценивают разность содержания супероксидрадикала в исследуемом воздухе пациента и здорового человека, которая характеризует супероксидную активность в исследуемом воздухе.