СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА МЕКОНИЯ, АССОЦИИРОВАННОГО С КЛЕТКАМИ ГЕРМИНАТИВНОЙ ЗОНЫ КРИПТ ТОЛСТОЙ КИШКИ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/53 A61K35/38 

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к иммунохимии эмбриональных и злокачественных тканей, и может быть использовано для получения антигена мекония, ассоциированного с клетками герминативной зоны крипт толстой кишки (гамма-МА), экспрессированного в отдельных пулах клеток рака толстой кишки. Это свойство антигена позволяет употреблять его в качестве дифференцировочного маркера при научном иммуногистохимическом исследовании первичных и метастических новообразований, а также в процессе патоморфологического диагноза.

Известен способ а.с. 1140291 получения органоспецифического антигена кишечника человека (бета-1-МА), заключающийся в обработке содержимого желудочно-кишечного тракта, включающей экстрагирование мекония забуференным физиологическим раствором, центрифугирование, добавление к недосадочной жидкости сульфата аммония до 30-70% насыщения, переосаждение ацетоном, диализа против забуференного физиологического раствора с последующей гель-хроматографией на колонке, заполненной сефарозой 4B с отбором фракций с относительной мол. м. 2000000 ± 1000000.

Однако данный антиген бета-1-МА характерен для большинства эпителиальных клеток кишечника на разных этапах эмбриогенеза и представлен в бокаловидных клетках толстой и тонкой кишки взрослого человека. В злокачественных новообразованиях он маркирует разнообразные пулы клеток, что не позволяет выделить, например, отдельные характерные для герминативной зоны опухолевые клетки.

Целью изобретения является выделение нового антигена мекония, ассоциированного с клетками герминативной зоны крипт толстой кишки.

Поставленная цель достигается путем введения иной схемы выделения вещества по сравнению с прототипом. В качестве исходного материала используется меконий, который аналогично схеме, описанной в прототипе, экстрагируют в забуференном физиологическом растворе (ЗФР), центрифугируют с отбором надосадка, выделяют белковую фракцию обработкой сульфатом аммония в интервале 30-70% насыщения соли и растворяют осадок. Для получения заявленного антигена далее данную фракцию мекония обрабатывают 0,05 М соляной кислотой под контролем pH-метра до pH 2,0, инкубируют в течение 5 мин, затем защелачивают трисом до исходного pH. Образовавшийся при обработке кислотой осадок удаляют центрифугированием, дальнейшее фракционирование проводят путем гель-хроматографии на сефакриле S-300 с отбором фракции с о.м.м. около 60 кД с последующим диализом и ионообменной хроматографией на DEAE-целлюлозе при pH 8,0 с отбором несвязавшейся при таких условиях фракцией, которую и используют для иммунизации кроликов.

Способ иллюстрируется фиг.1-5.

На фиг.1 дана реакция иммунодиффузии с применением стандартной тест-системы к гамма-МА, где 1- антисыворотка к гамма-МА; 2 - экстракт мекония в стандартном разведении; 3 - экстракт толстой кишки взрослого человека; 4 - экстракт печени; 5 - физиологический раствор; 6 - экстракт мекония плода 16-18 недель развития.

На фиг.2 приведен электрофорез в 7,5%-ном полиакриламидном геле.

Окрашено Кумасси P-250, где а - экстракт мекония (исходный материал для выделения); б - полуочищенный препарат гамма-MA (фракция; после обработки при pH 2,0); в - очищенный препарат гамма-МА.

На фиг. 3, а - дана хроматограмма смеси белков-метчиков для построения калибровочной кривой (сефакрил S-300, 0,05 М Na-фосфатный буфер pH 7,2 0,5 M NaCl, скорость протока 30 мл/ч), где 1 - голубой декстран (свободный объем), 2 - ферритин (480000), 3 - каталаза (240000), 4 - фосфатаза (100000), 5 - альбумин (67.000).

На фиг. 3, б - дана хроматограмма экстракта мекония, условия те же. Заштрихованный участок на профиле элюции - антигенная активность гамма-МА.

На фиг. 4 приведен перекрестный иммуноэлектрофорез с антисывороткой, полученной при иммунизации препаратом гамма-МА. Антиген - нативный экстракт мекония. С - старт, П - зона пиронина, А - зона альбумина. Окраска Кумасси Р-250.

На фиг. 5 приведена иммунопероксидазная реакция с использованием антисыворотки к гамма-МА. Докраска гематоксилином: а - слизистая оболочка фетальной толстой кишки, б - нормальная слизистая оболочка толстой кишки взрослого человека, в - рак толстой кишки.

Способ осуществляется следующим образом. Смешивают равные объемы мекония кишечника плодов человека и ЗФР, отделяют нерастворившиеся компоненты центрифугированием. Надосадок используют для выделения антигена. Меконий является идеальным источником гамма-МА (фиг.1), так как он наиболее богат антигеном (титр 1/64), так как он наиболее богат антигеном (титр 1/64), что соответствует при использовании полуколичественного иммунодиффузионного метода определения антигена со стандартной тест-системой около 300 мкг/мл. В экстрактах тканей кишечника взрослого человека и в опухолях кишечника генеза (выровненных по содержанию белка с экстрактом мекония) титр гамма-МА не превышает 1/1 (менее 10 мкг/мл), что делает нерентабельным использование этих источников.

К экстракту мекония (фиг. 2,a) добавляют сульфат аммония до насыщения 30%, удаляют осадок центрифугированием и к надосадку добавляют сульфат аммония до насыщения 70%. Осадок выделяют центрифугированием, растворяют в дистиллированной воде, повторно центрифугируют и надосадок обрабатывают 0,05 М соляной кислотой, доводя pH до 2,0, затем инкубируют 5 мин и защелачивают трисом до pH 7,0-7,8 (фиг.2,б). Полученный осадок удаляют центрифугированием, а надосадок после диализа гель-хроматографируют на сефакриле S-300 с отбором фракции, элюирующейся в области о.м.м. 60± 5 кД (фиг.3.а,б). Полученную гель-хроматографическую фракцию диализуют против 0,01 М трис-HCl буфера pH 8,0± 0,1 в течение 4 сут с 8-кратной заменой буфера. Затем проводят ионообменную хроматографию на DEAE-целлюлозе в том же буфере. Антиген гамма-МА при данном значении pH не сорбируют на колонке и полученный препарат используют для иммунизации животных (фиг.2,в) и получения моноспецифических антисывороток к гамма-МА (фиг.4).

В процессе приготовления антигена теряется около половины иммунохимической активности гамма-МА и конечный выход продукта составляет 50%.

Пример 1. Конкретное выполнение способа.

Меконий отделяют от кишечника плодов человека и смешивают с равным объемом ЗФР на магнитной мешалке. Нерастворившиеся компоненты отделяют центрифугированием при 10000 g в течение 30 мин. Недостаток используют для получения антигена. К 100 мл экстракта мекония медленно на магнитной мешалке добавляют 17 г сульфата аммония (30% насыщения) и мешают после растворения соли 30 мин. Осадок отделяют центрифугированием 10000 g, 30 мин. К надосадку на магнитной мешалке при постоянном помешивании добавляют 27 г сульфата аммония (70% насыщения), мешают 30 мин. Осадок ресуспендируют в 10 мл дистиллированной воды, осветляют центрифугированием 10000 g, 30 мин и добавляют к надосадку 0,05 М соляную кислоту под контролем pH-метра до pH 2,0. Инкубируют в течение 5 мин, затем защелкивают трисом до исходного pH. Осадок удаляют центрифугированием 10000 g, 30 мин, а надосадок диализуют против 5 л ЗФР при 4^oC и подвергают гель-хроматографии на сефакриле S-300 (Pharmacia, Швеция) в колонке 1,8 • 60, уравновешанной ЗФР, с отбором белковых фракций с относительной мол.м.60± 5 кД. Слитые вместе фракции диализуют 4 сут с 8-кратной заменой 0,01 М трис-HCl буфера pH 8,0 ± 0,1 при 4^oC, затем осветляют центрифугированием - 15000 g, 30 мин. Проводят ионообменную хроматографию на колонке с DEAE-целлюлозой (Merck) (3 х 10) в том же буфере с отбором фракций, не связавшихся при этих условиях и содержащих гамма-МА. Полученный антиген используют для иммунизации кроликов. На иммунизацию 1 кролика Шиншилла 4-5 кг используют около 100 мкг антигена. Антисыворотка от этих кроликов моноспецифична и реагирует с гамма-МА, содержащемся в меконии и экстрактах тканей нормального и малигнизированного кишечника. В эпителии толстой кишки антисыворотка реагирует с небольшим пулом клеток в дне крипт, подобная реакция характерна и для раковых опухолей толстой кишки ( фиг.5,а,б,в).

Пример 2. Выбор значений pH при обработке соляной кислотой. Данные приведены в табл.1.

Пример 3. Режимы использования pH при проведении ионообменной хроматографии. Данные приведены в табл.2.

Сравнительная характеристика гамма-МА по сравнению с прототипом представлена в табл. (табл.3-7).

Данный антиген может быть использован для уточняющей иммуногистохимической диагностики, например, первичного и метастатического рака толстой кишки (фиг. ).

Учитывая, что полученный антиген гамма-МА существенно отличается от описанного ранее антигена мекония бета-1-МА по молекулярной массе, относительной электрофорестической подвижности, отношению к ферментам, локализации в нормальной толстой кишке и т.д., оценивают заявляемый антиген как новый, ранее не описанный антиген мекония, ассоциированный с клетками герминативной зоны крипт толстой кишки и предлагают рассматривать заявку как "пионерскую".

Литература
Пугачев К.К., Васильев М.Ю, Авдеев Г.И. Способ получения органоспецифического антигена кишечника человека (бета-1-МА), а.с.1140291.8

Сущность: способ получения антигена мекония, ассоциированного с клетками герминативной зоны крипт толстой кишки, включает экстракцию мекония забуференным физиологическим раствором, центрифугирование, отбор надосадочной жидкости, давление в нее сульфата аммония в интервале 30 - 70% насыщения, повторное центрифугирование, отбор осадка, его растворение, обработку соляной кислотой при pH 2,0, защелачивание ТРИС до исходного pH, центрифугирование, отбор надосадочной жидкости, диализ, гель-хроматографию с отбором фракции 60+ 5,0 кД и последующую хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе при pH 8,0 с отбором неадсорбировавшихся фракций, содержащих целевой продукт. 7 табл., 5 ил.

Способ получения антигена мекония, ассоциированного с клетками герминативной зоны крипт толстой кишки, путем экстракции мекония забуференным физиологическим раствором, центрифугирования, отбора надосадочной жидкости с последующим добавлением сульфата аммония в интервале 30 - 70% насыщения, центрифугированием, отбором осадка, его растворением, обработкой, растворенного осадка соляной кислотой при рН 2, защелачиванием ТРИС до исходного рН, центрифугированием, отбором надосадочной жидкости, диализом, гель-хроматографией с отбором фракции 60 ± 5 кД и последующей хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе при рН 8 с отбором несорбировавшихся фракций, содержащих целевой продукт.