Способ получения @ -глобулина,ассоциированного с болезнью Крона Советский патент 1987 года по МПК G01N33/68 

1

Изобретение относится к области биохимии, преимущественно к препаративной биохимии, и может быть применено для разработки технологии получения Ы -глобулина толстой кишки,ассоциированного с болезнью Крона (РСАГ

I

Целью изобретения является разработка способа получения ы„ -глобулина, ассоциированного с болезнью Крона.

КАГ является новым, ранее нигде не описанным и не полученным белком и способ его получения является новым и строго специфическим.

Способ осуществляется следующим образом.

Ткань желудочно-кишечного тракта, пораженную болезнью Крона, тщательно отмьгоают от сгустков крови ,в забуфе- ренном физиологическом растворе, а затем гомогенизируют в гомогенизаторе Бионике (ВНР) при 10000 об/мин. Гомогенат смешивают с экстрагирующим буфером (трис-глициновый 0,05 М, рН 8,6 с добавлением твин-80 и тритон Х-100 в концентрации 1 мл на 1л буфера) в соотношении 3:1. Экстракт последовательно трехкратно замораживают и размораживают, а затем центрифугируют при 15000 об/мин в течение 30 мин. К надосадку прибавляют сульфат аммония до 75% насыщения и инкубируют на магнитной мешалке в течение 12.ч. Взвесь центрифугируют при 15000 об/мин в течение 30 мин при температуре -4°С. Осадок растворяют в 0,05 М натрийфосфатном буфере рН 7,4 и лиофилизируют. Лиофилизат растворяют в дистиллированной воде и ди- ализуют против натрийацетатного буфера |U 0,025 с рН 4,45 в течение 24 ч.Отдиализированньй препарат подвергают ионообменной хроматографии на DEAE-52 целлюлозе, уравновешенной натрийацетатным буфером fA 0,025 с рН 4,45. Элюцию КАГ проводят линейным градиентом хлорида натрия от 0,25 до 0,5 М, отбирая фракции в диапазоне 0,38-0,46 М хлорида натрия. Полученньш препарат диализуют против дистиллированной воды и лиофилизируют. Лиофилизат растворяют в , натрийацетатном буфере рН 5,6 и подвергают изохроматофокусир.ованию на целлюлозе DEAE-52 с элюцией 2%-ным раствором амфолинов рН 6-4 ирН4-2,5 (LKB,Швеция). При элюции отбирают фракцию в диапазоне рН 4,8-5,6.Фрак152

цию диализуют против дистиллированной воды в течение 24 ч и лиофилизируют. Лиофилизат растворяют в натрийфосфатном буфере 0,05 М с рН 7,4

и подвергают гель-хроматографии на сефадексе G - 150 с отбором фракции с,мол.м. 85 irlO кД. Полученный препарат подвергают конечной доочистке на иммуносорбенте, приготовленном на

основе цианбромированной сефарозы

4В и специфических антител к КАГ. Элюцию антител с. иммуносорбента прово- . дят 0,02 М ГЛИЦИН-НС1 буфером рН2,2. Конечньш препарат диализуют и лиофилизируют.

Анализ полученного препарата пока- зьшает высокую степень его очистки (в 2000 раз) с сохранением нативных свойств. Потери препарата при реализации предлагаемого спосо ба не превышают 30%. Принадлежность белка к cL- -глобулинам показана электрофоре- тически в полиакриламидном геле. Интервал элюции КАГ с ионообменного анионообменника определен экспериментально и находится в интервале 0,38 - 0,46 М хлорида натрия. Выбор определенной дискретной точки ИЗ этого интервала (например 0,38

или 0,42, или 0,46) невозможен, так

как это приведет к значительньм по- терям КАГ, который диффузно распределен именно в этой зоне.

Элюция раствором хлорида натрия

с молярностью меньше 0,38 М не приводит к отрыву КАГ с анионообменника. Элюирование раствором хлорида натрия более 0,46 М сопр1овождается снятием с носителя дополнительных примесей

белка, затрудняющих последующую очистку.

Отбор белковой фракции в интервале рН 4,8-5,6 диктуется тем, что изо- электрическая точка КАГ лежит именно в этом интервале, и в связи с этим ограничение отбора определенной дискретной точки (например: 4,8 или 5,2 или 5,6) сопровождается значительной потерей КАГ. Отбор белковой фракции с изоточками ниже 4,8 и выше 5,6 приводит к тому, что КАГ с носителя не снимается. .

Амфелины с рН 6-4 и рН 4-2,5 поз- воляют создать градиент рН 5,8-3,0, что строго специфично для КАГ.

Пример 1. 50 г ткани толстой кишки, пораженной болезнью Крона, тщательно отмывали от сгустков крови

313189

забуферен 1ом физиологическом расторе, а затем гомогенизировали в гоогенизаторе Биомикс (ВНР) при 10000 об/мин. Гомогенат смешивали с экстрагирующим буфером - трис-глици- новый 0,05 М рН 8,6 с добавлением твин-80) (Merk, ФРГ) и тритон Х-100 (Ferrok ГДР) в концентрации, мл на 1л буфера - в соотношении 3:1, Экстракт последовательно трехкратно 10 замораживали и размораживали, после чего центрифугировали при 1 5000 об/мин в течение 30 мин. К надосадку добавляли сульфат аммония до 75% насыщения и инкубировали на магнитной ме- 15 шалке в течение 12 ч. Взвесь центрифугировали при 15000 об/мин в течение 30 мин. Осадок растворяли вО,05М натрийфосфатном буфере рН 7,4 и лио- филизйровали. Лиофилизат растворяли 20 в дистиллированной воде и диализова- ли против натрийацетатного буфера (ионная сила 0,025; рН 4,45) в течекие. 24 ч. Отдиализованный препарат подвергали ионообменной хроматогра- 25 фии на DEAE-52 целлюлозе (Watwan, Англия), уравновешанной натрийацетат- ньп-1 буфером (ионная сила 0,025; рН 4,45). Элюцию КАГ проводили градиентом хлорида натрия от 0,25 до 30 0,5 М с отбором белковой фракции в диапазоне 0,38-0,46 М хлорида натрия. Полученный препарат диализовали против дистиллированной воды и лио филизировали. Лиофилизат растворяли 35 в натрийацетатном буфере рН 5,6 и подвергали изохроматофокусированию

на целлюлозе DEAE-52 (Watwan, Англия) с элюцией 2%-ным раствором ам- фолинов с рН 6-4 и рН 4-2,5 (LKB, 40 Швеция). При элюции отбирали фракцию в диапазоне рН 4,8-5,6, Фракцию диализовали против дистиллированной воды в течение 24 ч и лиофилизировали. Лиофилизат растворяли в натрийфос- 45 фатном буфере 0,06 М, рН 7,4 и подвергали гель-хроматографии на сефа- дексе G-150 (Pharmatia Fine Cemi- cals, Швеция) с отбором фракции с мол,м . 85±10 кД, Полученный препарат 50 подвергали конечной доочистке на им- муносорбенте, приготовленном на основе цианбромированной сефарозе 4В (Pharmatia. Fine Cemicals, Швеция) и специфических антител к КАГ. Элю- 55 цию антител с иммуносорбента проводили 0,02 М ГЛИЦИН-НС1 буфером рН2,2. Конечный препарат диализовали и лио154

филизировали; Реализация предлагаемого способа позволяла получать 672 мкг препарата КАГ с чистотой 98,5%,

Пример2, 50 г ткани толстой кишки, пораженной болезнью Крона, тщательно отмывали от сгустков крови в забуференном физиологическом растворе, а затем гомогенизировали в гомогенизаторе БИОМИКС (ВНР) при 10000 об/мин. Гомогенат смешивали с экстрагирующим буфером - трис-глици- новый 0,05 М; рН 8,6 с добавлением твин-80 (Merk, ФРГ) и тритон Х-100 (Ferror, ГДР) в концентрации 1 мл на 1 мл буфера - в соотношении 3:1, Экстракт последовательно трехкратно замораживали и размораживали, после чего центрифугировали при 5000об/ми в течение 30 мин. К надосадку добавляли сульфат аммония до 75% насыщения и инкубировали на магнитной мешалке в течение 12 ч. Взвесь центрифугировали при 15000 об/мин в течение 30 мин.Осадок растворяли в 0,05 М натрийфосфатном буфере рН 7,4 и лиофи.пизировали. Лиофилизат растворяли в дистиллированной воде и диализовали против натрнйацетатного буфера (ионная сила 0,025; рН 4,45) в течение 24 ч, Отдиализованный препарат подвергали ионообмен.чой хроматографии на DEAE-52 целлюлозе (Watwan, Англия), уравновешенной натр шацетат ным буфером (vioHHaH сила 0,025; рН 4,45), Элюцию IvfXr проводили 0,46 М раствором хлорида натпи--;, Полученный препарат дяализовали против дистиллированной воды и лиофнлизировали. Лиофи.пизат растворя.пи з натршЧацетат ном буфере рН 5,6 и пoдвepгaлv изо- хроматофокусированню на целлюлозе DE/LE 52 (Watwan, Англия) с элюцией 2%-Шз1м pacтвopo амфолипо.в с рН 6-4 и рН 4-2.5 (LKB, Швеция). При ции отбирал) фракп г,и з диапазоне рН 4,8-5,6. Фракц до д из , овали против дистиллированной воды Б течение 24 ч и лиофи.пизировали, Лнофнлизат растворяли в натрийфосфатном буфере 0,05 М рИ 7,4 к подве;згали гель-хроматографии на сефадексе G--150 (Pharmacia Fine Chemicals, Швеция) с отбором фракции с мол.м. кД,. Полученный препарат пог.роргал конечной доочистке на иммуносорбенте,, при готовлешшь на основе nuaiiGpoMupo- ванной сефарозЕ-. 4В (rhininaci-a Fi513

ne Chemicals, Швеция) и специфических антител к КАГ. Элюцию антител с иммуносорбента проводили 0,02 М глицин-НС буфером рН 2,2. Конечный препарат диализовали и лиофилизировали. Реализация предлагаемого способа позволила получить 672 мкг препарата КАГ с чистотой 78%.

Ф о р м у л а изобретения

Способ получения, с.,j -глобулина, ассоциированнога с болезньр Крона, включающий гомогенизацию ткани желудочно-кишечного тракта, поражен- ной болезнью Крона, экстракцию буферным раствором при рН 8,6 с добавлением детергентов, высаливание экс-. тракта, далее полученньш осадок растворяют, диализуют, хроматографируют с помощью анионообменного носителя,.

18915-6

при этом проводят ЭЛЮЦИЮ в линейном

градиенте хлористого натрия от 0,25 до 0,5 М, отбирают фракции препарата в диапазоне 0,38-0,46 М хлористого натрия и лиофилизируют их, далее растворенный лиофилизат подвергают изо- хроматофокусированию и отбирают фракции в диапазоне рН 4,8-5,6 и лиофилизируют их, растворенный лиофилизат подвергают гель-хроматографии на С-150 с отбором фракции, имеющей мол.м. 85±10 кД, далее полученную фракцию используют для приготовления антительного иммуносорбента, при этом в качестве сорбента берут циан- бромированную сефарозу, далее препарат с мол.м. 85+10 кД подвергают очистке на полученном иммуносорбенте путем элюции его 0,02 М буферным раствором при рН 2,2, элюат диализуют и лиофильно высушивают.

Изобретение относится к биохимии. Целью является разработка способа получения olg-глобулина, ассоциированного с болезнью Крона. Ткань желудочно-кишечного тракта, пораженную болезнью Крона, гомогенизируют, смешивают с экстрагирующим буфером (трис-глициновый 0,05 М, рН 8,6 с добавлением твин - 80 и тритон Х-100 в концентрации 1 мл на I л буфера) в соотношении 3:1. Экстракт замораживают и размораживают, центрифугируют при 15000 об/мин в течение 30 мин. К надосадку добавляют сульфат аммония до 75% насыщения, инкубируют в течение 12 ч. Взвесь центрифугируют при 15000 об/мин в течение 30 мин при температуре -4°С. Осадок растворяют в 0,05 М натрийфосфатном буфере рН 7,4 и лиофилизируют. Лиофилизат растворяют и диализируют против натрий- ацетатного буфера ,025 с рН4,45 в течение 24 ч, хроматографируют на целлюлозе ДЕАЕ - 52, уравновешивают натрийацетатным буфером /ц 0,025 с рН 4,45.. Элюируют линейным градиентом Хлорида натрия О,25-0,5м, отбирая фракции в диапазоне 0,38-0,46 М хлорида натрия, диализуют против дистиллированной воды и лиофилизируют. Лиофилизат растворяют в натрийацетат- ном буфере рН 5,6, изохроматофокуси- руют на целлюлозе ДЕАЕ - 52 и элюи- руют 2%-ным раствором амфолинов, рН 6-4 и 4-2,5, отбирают фракцию в диапазоне рН 4,8-5,6 и-лиофилизируют. Лиофилизат растворяют в натрийфосфатном буфере 0,05 М рН 7,4 и гель - хроматографируют на сефадексе G-150 с отбором фракции с мол,м.85±10 кД. Препарат подвергают конечной доочист- ке на иммуносорбенте на основе циан- бромированной сефарозы 4Б и специфических антител, которые элюируют 0,02 М глицин - НС1 буфером рН 2,2, диализируют и лиофилизируют. а « сл &0 00 со