СПОСОБ ИММУНИЗАЦИИ ПРОТИВ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗЫВАЕМОЙ ВИРУСОМ КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА Российский патент 1999 года по МПК A61K39/12 C12N15/40 C12N15/86 C12N7/01 

Изобретение относится к медицине, а именно к способам специфической иммунопрофилактики вирусных инфекций.

Вирус клещевого энцефалита (КЭ) относится к семейству флавивирусов и является возбудителем заболевания, вызывающим особо опасную инфекцию головного мозга.

Известны способы иммунизации против инфекции, вызываемой вирусом клещевого энцефалита инактивированной культуральной вакциной или живой вакциной против клещевого энцефалита [1] . Инактивированная вакцина изготовлена из штамма Софьин путем инактивации вируса формалином. Живую вакцину получают путем аттенуации патогенных штаммов вируса клещевого энцефалита. Вакцины вводят в организм путем внутримышечных или подкожных инъекций. В результате вакцинации формируется системный иммунитет, препятствующий распространению в организме вируса клещевого энцефалита и поражению головного мозга.

Разработана рекомбинантная вакцина против клещевого энцефалита на основе штамма ЛИВП вируса осповакцины со встройкой в геном этого вируса генов, кодирующих структурные и неструктурные белки вируса клещевого энцефалита [2] . Рекомбинантную вакцину вводят в организм путем скарификации кожного покрова.

К недостаткам указанных способов иммунизации [1, 2] относится сложная технология введения вакцины в организм, которая требует участия квалифицированного персонала, особых условий подготовки инъекционного оборудования, а процесс иммунизации связан с нарушением целостности кожного покрова и возможными осложнениями в связи с проникновением в месте введения вакцины патогенных микроорганизмов или вирусов. Кроме того, после введения вакцины указанными способами создается дополнительная нагрузка на системный иммунитет организма.

Наиболее близким техническим решением к предлагаемому изобретению (прототипом) является способ вакцинации против клещевого энцефалита путем подкожного введения инактивированной сорбированной вакцины КЭ на основе штамма 205 [3]. Вакцину вводят в количестве 1,0 мл трехкратно с интервалом 30 и 105 дней или двукратно с интервалом 30 дней.

К недостаткам данного способа иммунизации [3] относится сложная технология введения вакцины в организм, которая требует участия квалифицированного персонала, особых условий подготовки инъекционного оборудования, а процесс иммунизации связан с нарушением целостности кожного покрова и возможными осложнениями в связи с проникновением в месте введения вакцины патогенных микроорганизмов или вирусов. Кроме того, после введения вакцины указанным способом создается дополнительная нагрузка на системный иммунитет организма.

Задачей предлагаемого технического решения является создание более простого способа вакцинации организма без нарушения кожного покрова, который позволил бы обеспечить защиту головного мозга от вирусной инфекции клещевого энцефалита при парэнтеральном заражении путем формирования локального иммунитета слизистой носовой полости, а также снизить нагрузку на системный иммунитет и уменьшить количество вводимого в организм препарата.

Указанная задача решается тем, что в способе иммунизации против инфекции, вызываемой вирусом клещевого энцефалита, включающем введение в организм вакцины против клещевого энцефалита, согласно изобретению в качестве вакцины используют рекомбинантную вакцину против клещевого энцефалита на основе вируса осповакцины, причем указанную вакцину вводят в организм интраназально в область обонятельного нейроэпителия слизистой носа в дозе (0,5-5,0)•10⁶ OOE.

В качестве рекомбинантной вакцины против клещевого энцефалита на основе вируса осповакцины используют вакцину, приготовленную на основе штамма KV 7,5 CMENS 123 (штамм ГКВ N 945) или WR 7,5 CMENS 123.

При введении в организм живой рекомбинантной вакцины против КЭ в дозе менее 0,5•10⁶ OOE не обеспечивается его 100%-ная защита от указанной инфекции.

При введении в организм живой рекомбинантной вакцины против КЭ в дозе более 5,0• 0⁶ OOE наблюдается перерасход этой вакцины без увеличения эффективности ее действия и увеличение нагрузки на системный иммунитет, т.к. титр живой вакцины в организме в течение нескольких суток способен увеличиваться до требуемого уровня.

Штамм KV 7,5 CMENS 123 (штамм ГКВ N 945) депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского под номером ГКВ N 945 (авторское название KV 26). На указанный штамм имеется патент РФ N 2112038, МПК C 12 N 15/40, опубл. 27.05.98, где приведены его подробные характеристики и технология получения.

Штамм WR 7,5 CMENS 123 депонирован в государственной коллекции вирусов Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ГНЦ ВБ "Вектор") под номером ГКВ N 295. Характеристики штамма опубликованы в:
Хромых А. А. Экспрессия белков вируса клещевого энцефалита рекомбинантными вирусами осповакцины. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биол. наук. - Новосибирск, 1990, с. 17-67.

Паспорт штамма WR 7,5 CMENS 123 (ГКВ 295) содержит следующие характеристики.

1. Морфология, признаки штамма. Рекомбинантный штамм WR 7,5 SMENS 123 обладает свойствами типичного представителя семейства ортопоксвирусов. Вирионы штамма имеют размер 200х300 нм, характерную брикетообразную форму и по данным электронной микроскопии не отличаются от исходного штамма.

2. Вирус. Вирус осповакцины, содержащий гены структурных (C, M, E) и неструктурных (NS1, NS2a, NS2b, NS3) белков вируса клещевого энцефал.

3. Штамм относится к штаммам WR вируса осповакцины
4. Источник получения: Культивирование на культуре клеток Hu-143.

5. Пассажная история: Шесть пассажей на культуре клеток Hu-143, один пассаж на ХАО РКЭ, один пассаж на культуре клеток CV-1
6. Условия поддержания: Культивирование при 37^oC на культурах клеток Hu-143, CV-1 или на ХАО РКЭ.

7. Система культивирования: Культивирование на монослое клеток в среде Игла MEM с 2,5% фетальной сыворотки.

8. Свойства штамма: В ген тимидинкиназы вируса осповакцины (штамм WR) клонированы гены, кодирующие структурные (C, M, E) и неструктурные (NS1, NS2a NS2b, NS3) вируса клещевого энцефалита штамма Софьин под контролем промотора вируса осповакцины 7,5К. Белки C, M, E, NS1, NS2a, NS2b, NS3 экспрессируются в зараженных культурах клеток. Штамм утратил нейроинвазивность на мышах при периферических способах заражения.

9. Вирулентные и токсикогенные свойства: Штамм безвреден в тесте на морских свинках и беспородных мышах. При внутримозговом введении кроликам в дозе 5•10⁴ OOE не вызывает гибели животных.

10. Условия хранения: Гарантированное, в лиофильно высушенном состоянии при - 20^oC.

Для многих штаммов нейротропных вирусов показано, что патоген может проникать в головной мозг, инфицируя окончания обонятельного нерва, находящиеся на поверхности слизистой носовой полости [6-12]. В частности для вируса Венесуэльского энцефаломиелита лошадей показано, что его распространение в ЦНС по обонятельному тракту слабо контролируется гуморальными факторами системного иммунитета [11], а для представителя семейства флавивирусов вируса Сент-Луис показано, что он распространяется в головной мозг, инфицируя клетки обонятельного нейроэпителия и обонятельного тракта [12]. В результате предшествующих экспериментальных исследований, послуживших созданию предлагаемого технического решения, и литературных данных можно сделать вывод, что вирусы, не создающие высоких уровней виремии, в частности некоторые флавивирусы и их представитель вирус клещевого энцефалита, проникают в ЦНС после периферического заражения по следующему пути: "кровоток - клетки боуменовых желез - поверхность слизистой носа - окончания обонятельного нерва - внутриаксональный транспорт - ЦНС". Таким образом область обонятельного нейроэпителия является центральным звеном на пути распространения флавивирусов в головной мозг. Следовательно, блокируя распространение вируса клещевого энцефалита через чувствительные к вирусу клетки обонятельного нейроэпителия путем интраназального заражения клеток слизистой носа вакцинным вирусным штаммом и формируя таким образом локальный иммунитет слизистой, можно защитить головной мозг от проникновения вируса клещевого энцефалита.

Известны способы интраназального применения вакцин против респираторных вирусных инфекций [11, 12], причем в качестве вакцин используются живые аттенуированные или рекомбинантные штаммы, способные размножаться в клетках дыхательного тракта. Интраназальная вакцинация против респираторных вирусных инфекций обеспечивает формирование локального иммунитета слизистой дыхательного тракта, что предотвращает проникновение указанной инфекции в организм через дыхательный тракт.

В предлагаемом способе интраназальная вакцинация против вируса КЭ также обеспечивает формирование локального иммунитета слизистой носовой полости. Однако в отличие от известных способов вакцинации [11, 12] предлагаемый способ обеспечивает защиту головного мозга от проникновения вирусной инфекции клещевого энцефалита при парэнтеральном заражении (укус клеща).

Интраназальное применение живых вакцин из штаммов вируса клещевого энцефалита в известных источниках информации не описано.

Таким образом, совокупность существенных признаков предлагаемого изобретения, отличающихся от существенных признаков прототипа, неизвестна из опубликованных источников информации, что позволяет сделать вывод о соответствии предлагаемого технического решения критерию "изобретательский уровень".

Пример 1. Предлагаемая методика иммунизации против инфекции, вызываемой вирусом клещевого энцефалита
Для иммунизации применяют живую рекомбинантную вакцину против клещевого энцефалита на основе вируса осповакцины. Вакцину готовят на основе штамма KV 7,5 CMENS 123 (штамм ГКВ N 945) или штамма WR 7,5 CMENS 123. С помощью пипетки или специального шприца вакцину вводят в организм интраназально в область обонятельного нейроэпителия слизистой носа в дозе (0,5-5,0)•10⁶ OOE. Эксперименты показывают, что наиболее оптимальной является доза препарата 10⁶ OOE при объеме инокулята 0,02 мл. При этом через несколько дней обеспечивается 100%-ный защитный эффект организма в случае парэнтерального его заражения вирусом клещевого энцефалита, например при укусе инфицированным клещом.

Пример 2. Экспериментальные исследования эффективности иммунизации организма против инфекции, вызываемой вирусом КЭ традиционными способами (внутрикожно и подкожно)
Для сравнения эффективности вакцинации коммерческой инактивированной вакциной против клещевого энцефалита и двух рекомбинантных штаммов вируса осповакцины (штамм WR 7,5CMENS123 из родительского штамма WR вируса осповакцины и штамм KV 7,5CMENS123 из родительского штамма LIVP вируса осповакцины) со встроенными генами структурных и неструктурных белков вируса клещевого энцефалита проводят внутрикожную вакцинацию (в основание хвоста) мышей линии BALB/C рекомбинантными штаммами и подкожную вакцинацию коммерческой вакциной против клещевого энцефалита. Иммунизирующая доза для рекомбинантных штаммов составляет 10⁶ OOE (объем инокулята 0,02 мл), а инактивированную коммерческую вакцину вводят подкожно в объеме 0,2 мл. Контрольной группе вводят подкожно стерильный раствор Хенкса в объеме 0,2 мл. Через три недели после вакцинации всех животных заражают внутрибрюшинно вирусом клещевого энцефалита (штамм Софьин) различными разведениями (с десятикратным шагом) исходного вирусного материала, который представляет собой десятипроцентный гомогенат головного мозга заболевших мышат с активностью 9,0 lg LD50 при интрацеребральном заражении мышей. Из таблицы 1 видно, что максимальная степень защиты наблюдается при подкожном применении коммерческой инактивированной вакцины против клещевого энцефалита (погибло 8,3% из общего числа зараженных животных), а минимальная зашита наблюдается при внутрикожном применении рекомбинантной вакцины kv 7,5CMENS123 (погибло 49,2% животных).

Пример 3. Экспериментальные исследования эффективности иммунизации организма против инфекции, вызываемой вирусом КЭ предлагаемым интраназальным способом
Протективный эффект интраназальной иммунизации живой рекомбинантной и инактивированной коммерческой вакцинами против клещевого энцефалита продемонстрирован в опытах на мышах BALB/c, которых наркотизируют эфиром и вводят по 50 мкл вакцинного материала интраназально (рекомбинантного штамма в дозе 10⁶ OOE). Контрольной группе вводят интраназально по 50 мкл раствора Хенкса. Через три недели после иммунизации всех животных заражают внутрибрюшинно различными разведениями вируса клещевого энцефалита (штамм Софьин), который представляет собой десятипроцентный гомогенат головного мозга заболевших мышат с активностью 9,0 lg LD50 при интрацеребральном титровании на мышах. Из таблицы 2 видно, что в отличие от результатов, представленных в таблице 1 (таблицы 1-3 см. в конце описания), максимальную защиту дает интраназальное введение рекомбинантного штамма WR 7,5CMENS123 (защищено 100% зараженных животных), тогда как интраназальное введение инактивированной коммерческой вакцины против клещевого энцефалита не дает практически значимой защиты (погибло 81,6% зараженных животных).

Пример 4. Анализ экспериментальных данных, полученных в примерах 1, 2
Представленные в таблицах 1,2 экспериментальные данные сравнивают по критерию хи-квадрат на значимость отличий по вероятности гибели животных [13] . Результаты статистического оценивания экспериментальных данных представлены в таблице 3.

Проверка по критерию хи-квадрат нулевой гипотезы о том, что сравниваемые группы животных (NN1-8) не отличаются между собой по вероятности гибели животных. В клетках таблицы 3 указана статистическая надежность (%), с которой отвергается нулевая гипотеза о неотличимости групп.

Анализ таблицы 3 позволяет сделать следующие выводы.

1. Подкожная иммунизация коммерческой вакциной и интраназальная иммунизация рекомбинантными вакцинами (группы животных 3 и 5, 6) значимо не отличаются (на уровне более 99,9%) по эффективности защиты.

2. Эффективность защиты при интраназальном применении рекомбинантных вакцин wr7,5CMENS123 и kv7,5CMENS123 не отличается с вероятностью более 99,9%, группы животных 5 и 6.

3. Протективные свойства рекомбинантного штамма wr7,5CMENS123 не изменяются при интраназальном или внутрикожном применении, (вероятность 97,5%), группы животных 1 и 5.

4. В противоположность рекомбинантному штамму (п.3) эффективность защиты при интраназальном и подкожном применении коммерческой инактивированной вакцины отличается значимо (вероятность более 99,9%), группы животных 3 и 7.

5. Интраназальная иммунизация рекомбинантными штаммами значимо превосходит по протективности интраназальную иммунизацию инактивированной вакциной (вероятность более 99%), группы животных 7 и 5, 6.

6. Подкожная иммунизация коммерческой инактивированной вакциной и внутрикожная вакцинация рекомбинантным штаммом wr7,5CMENS123 дают высокую степень защиты и значимо не отличаются между собой по протективности (вероятность более 97,5%), группы животных 1 и 3.

7. Внутрикожная вакцинация рекомбинантным штаммом kv7,5CMENS123 не дает высокой степени защиты и значимо отличается по протективности от подкожной вакцинации коммерческой инактивированной вакциной (вероятность более 95%), группы животных 2 и 3.

Таким образом протективные свойства интраназального способа вакцинации с использованием рекомбинантных вакцин не хуже традиционного способа подкожной вакцинации инактивированной вакциной против клещевого энцефалита, но при этом предлагаемый способ имеет ряд существенных преимуществ.

Преимущества предлагаемого способа.

1. При интраназальной вакцинации не нарушается целостность кожного покрова, вследствие чего устраняются возможные осложнения.

2. Формируется локальный иммунитет слизистой оболочки носовой полости непосредственно в области проникновения вируса клещевого энцефалита в головной мозг, вследствие чего не создается дополнительная нагрузка на системный иммунитет и не происходит общей сенсибилизации и аллергизации организма, что весьма важно для лиц с ослабленной иммунной системой.

3. Иммунитет слизистой слабо подвержен возрастным изменениям в отличие от системного иммунитета, вследствие чего с возрастом повышается надежность иммунизации предлагаемым способом.

4. Количество вакцины, необходимой для создания определенного уровня защиты, уменьшается по сравнению со способом-прототипом в несколько раз (в 4-5 раз для мышей), а при применении специального катетера или аэрозольного баллона - в несколько десятков раз.

Источники научно-технической и патентной информации
1. Смородинцев А.А., Дубов А.В. Клещевой энцефалит и его вакцинопрофилактика. Л.: Медицина, 1986, стр. 175-190.

2. Авт. свид. SU N 1490963, МКИ C 12 N 15/00, опубл. 07.07.93.

3. Авт. свид. SU N 1722503, МКИ A 61 K 39/12, опубл. 30.03.92. (прототип).

4. Larson. E.W., Dominik, J.W., Slone. Th.W. - Aerosol stability and respiratory infectivity of Japanese В encephalitis virus. - Infect. Immun., 1980, v. 30, p. 397-401.

5. Nir. Y., Beemer A., Goldwasser, R.A. - West Nile virus infection in mice following exposure to a virus aerosol. - Brit. J. Exp. Pathol., 1965, v. 46, p. 443.

6. Grimley, P.M., Friedman, R.M. - Development of Semliki Forest virus in mouse brain: an electron microscopic study. - Exp. Mol. Pathol., 1970, v. 12., p. 1.

7. Davis, L.E., Johnson, R.T. - An explanation for the localisation of herpes simplex encephalitis? - Ann. Neurol., 1979, v. 5, p. 2.

8. Goto, N., Hirano, N., Aiuchi, M., Hayashi, Т., Fujiwara, K. - Nasoencephalopathy of mice infected intranasally with mouse hepatitis virus, JHM strain. - Jap. J. Exp. Med., 1977, v. 47, p. 59-70.

9. Ryzhikov А. В., Ryabchikova E.I., Sergeev A.N., Tkacheva N.V. Venezuelan equine encephalitis virus propagation in olfactory tract of normal and immune mice// Arch.Virol. - 1995, v. 140, p. 2243-2254.

10. Monath, T.P., Cropp, C.B., Harrison, A.K. - Mode of entry of a neurotropic arbovirus into the central nervous system. Reinvestigation of an old controversy. - Lab. Invest., 1983, v. 48, p. 399.

11. Авт. свид. SU N 1731811, МКИ C 12 N 7/00, опубл. 07.05.92.

12. Small P.A., Smith G.L., Moss B. In: Vaccines 85. Ed. Cold Spring Harbor Lab. Intranasal Vaccination with a Recombinant Vaccinia Virus Containing Influenza Hemagglutinin Prevents Both Influenza Virus Pneumonia and Nasal Infection: Intradermal Vaccination Prevents Onlu Viral Pneumonia. - 1985, pp. 175-176.

13. Ашмарин И. П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Медгиз, 1962.

Изобретение предназначено для специфической иммунопрофилактики клещевого энцефалита. Для иммунизации применяют живую рекомбинантную вакцину против клещевого энцефалита на основе вируса осповакцины. Вакцину готовят на основе штамма KV 7,5 CMENS 123 (штамм ГКВ N 945) или штамма WR 7,5 CMENS 123. С помощью пипетки или специального шприца вакцину вводят в организм интраназально в область обонятельного нейроэпителия слизистой носа в дозе (0,5 - 5,0) • 10⁶ ООЕ. Наиболее оптимальной является доза препарата 10⁶ ООЕ при объеме инокулята 50 мкл. Изобретение позволяет упростить способ вакцинации организма без нарушения кожного покрова. При этом обеспечивается защита головного мозга от вируса клещевого энцефалита при параэнтеральном заражении за счет формирования локального иммунитета слизистой носовой полости, а также снижается нагрузка на системный иммунитет и уменьшается количество вводимого в организм препарата. 1 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Способ иммунизации против инфекции, вызываемой вирусом клещевого энцефалита, включающий введение в организм вакцины против клещевого энцефалита, отличающийся тем, что в качестве вакцины используют рекомбинантную вакцину против клещевого энцефалита на основе вируса осповакцины, причем указанную вакцину вводят в организм интраназально в область обонятельного нейроэпителия слизистой носа в дозе (0,5-5,0)•10⁶ OОЕ. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве рекомбинантной вакцины против клещевого энцефалита на основе вируса осповакцины используют вакцину, приготовленную на основе штамма КV 7,5 СМЕNS 123 (штамм ГКВ 945) или WR 7,5 СМЕNS 123.