РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PTLS, СОДЕРЖАЩАЯ ГЕН ОДНОЦЕПОЧЕЧНОГО АНТИТЕЛА ПРОТИВ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА, И ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI-ПРОДУЦЕНТ ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫХ АНТИТЕЛ ПРОТИВ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА Российский патент 2000 года по МПК C12N15/40 C12N15/13 C12N1/21 C12N1/21 C12R1/19 

Изобретение относится к биотехнологии, генной и белковой инженерии, конкретно - к получению одноцепочечных антител против вируса клещевого энцефалита.

Вирус клещевого энцефалита (КЭ), представитель семейства Flaviviridae, является высокопатогенным инфекционным агентом, вызывающим серьезные поражения нервной системы. Уровень заболеваемости клещевым энцефалитом растет, а единственным специфическим и достаточно надежным средством лечения является донорский противоэнцефалитный гамма-глобулин. Острый дефицит этого препарата, его высокая цена и возможный биологический риск, связанный с его применением, делают необходимым поиск альтернативных терапевтических средств. Применение моноклональных антител для профилактики и терапии клещевого энцефалита остается крайне проблематичным. Поэтому особенно актуально создание искусственных антител для использования их в качестве лекарственных средств.

В последние годы опубликован ряд работ, посвященных созданию искусственных антител, которые, как полагают, будут более дешевыми, безопасными и более эффективными, чем иммуноглобулины, выделенные из крови иммунизированных животных и людей. Большой интерес представляют одноцепочечные антитела, которые состоят из вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов, объединенных гибким пептидным линкером. Небольшие размеры одноцепочечных антител облегчают проникновение их в ткани и выведение из организма [1, 2]. Кроме того, отсутствие константных доменов приводит к значительному снижению иммуногенности этих молекул, что позволяет рассчитывать на их использование в медицинской практике, в частности, для борьбы с вирусными заболеваниями.

Известны работы по получению одноцепочечных антител к разнообразным антигенам, в том числе к рецепторам раковых клеток [3, 4], ферритину человека [5] , риновирусу человека [6]. Получены одноцепочечные антитела к вирусу шотландского энцефаломиелита овец (LIV), принадлежащего к семейству Flaviviridae, которые обладают вируснейтрализующей активностью [7].

В результате слияния мышиной миеломы P3/X63 Ag8.653 со спленоцитами мыши, иммунизированной очищенным белком E вируса КЭ, получены мышиные моноклональные антитела гибридомной клеточной линии E6B (МКА E6B), которые распознают группоспецифический эпитоп вирусов комплекса КЭ, блокируют гемагглютинирующую активность вируса КЭ и обладают вируснейтрализующей активностью [8] . Описанные антитела взаимодействуют с доменом E2 гликопротеина E, играющим основную роль в формировании вируснейтрализующих и протективных антител. К этим антителам получены антиидиотипические антитела, распознающие идиотип E6B. Было показано также, что МКА E6B распознают район гликопротеина E, взаимодействующий с клеточным рецептором [9]. Однако в мире не существует аналогов рекомбинантных одноцепочечных антител против вируса клещевого энцефалита.

Технической задачей изобретения является создание плазмидной ДНК, содержащей гены вариабельных доменов МКА E6B против вируса клещевого энцефалита, и бактериального штамма бактерий Escherichia coli - продуцента одноцепочечных антител против вируса клещевого энцефалита.

Поставленная цель достигается конструированием плазмиды pTLS путем встройки в плазмидный вектор pGEM1 фрагмента ДНК, кодирующего лидерный пептид пектатлиазы В (pelB) Erwinia carotovora, и генов вариабельных доменов МКА E6B против вируса клещевого энцефалита в составе единой ДНК-последовательности. Полученная в результате плазмида pTLS состоит из:
- генов вариабельных доменов МКА E6B, объединенных олигонуклеотидным коннектором, размером 742 п.о.,
- фрагмента ДНК, кодирующего 22 а.к. лидерного пептида pelB Erwinia carotovora и регуляторные элементы гена pelB, размером 220 п.о.,
- плазмидного вектора pGEM1, обеспечивающего эффективную транскрипцию полученного гена одноцепочечных антител и его экспрессию.

Гены вариабельных доменов МКА E6B были получены на основе мРНК, выделенной из клеток гибридомы E6B [8], в системе обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции по методу [10] с использованием в качестве праймеров Vh for 5'TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCC и Vk for 5'GTTAGATCTCCAGCTTGGTCCC, комплементарных 3'-концу мРНК, кодирующих вариабельные домены тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов мыши соответственно, и Vh back 5'AGGTIIAICTICTCGAGTCAGG и Vk back 5'GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCA, комплементарных 5'-концу мРНК, кодирующих вариабельные домены тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов мыши соответственно. Коннектор, кодирующий линкерный пептид (Gly₄Ser)₃, получали отжигом олигонуклеотидов: 5'GTCACCGTCTCCTCAGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGT, 5'GGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGACATTGAGCT, 5'GAGCCACCGCCACCTGAGGAGACG, 5'CAATGTCAGATCCGCCGCCACCCGACCCACCACCGCC согласно [10] и сшивали при помощи лигазы фага T4 с 3'-концом гена вариабельного домена тяжелой цепи по BstEII сайту рестрикции и с 5'-концом гена вариабельного домена легкой цепи по SacI сайту. Фрагмент ДНК, кодирующий лидерный пептид pelB Erwinia carotovora был получен в полимеразной цепной реакции с использованием в качестве матрицы плазмиды pET(rF11) [5] и олигонуклеотидных праймеров: 5'- CCGCTCGAGCAGCTGCACCTGGGC, 5'-GGAATTCGACCACACTCCCCTTG, обеспечивающих в амплификационном фрагменте сайты рестрикции EcoRI и XhoI.

В качестве плазмидного вектора, обеспечивающего встройку фрагмента, кодирующего лидерный пептид, и гена одноцепочечного антитела и его экспрессию под контролем позднего промотора T7 ДНК-полимеразы, использовали плазмиду pGEM1 ("Promega"), обработанную рестриктазами EcoRI и HindIII.

Для получения штамма-продуцента одноцепочечных антител компетентные клетки бактерий Escherichia coli BL21(DE3) (F^-, ompT, hsd S_b(r_b ^-, m_b ^-), gal dcm (DE3)) трансформировали сконструированной плазмидой pTLS. Полученный таким образом штамм E.coli BL21(DE3)/pTLS характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Клетки мелкие утолщенной палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.

Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаре "Difko" - колонии круглые, гладкие, прижатые, мутные, блестящие серые, край ровный. При росте на жидких средах (на минимальной среде с глюкозой или LB бульоне) образуют интенсивную ровную муть. Клетки растут при температуре 37^oC при оптимуме pH от 6.8 до 7.0.

Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к ампициллину (100 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды.

Штамм E.coli BL21(DE3)/pTLS обеспечивает индуцируемый ИПТГ синтез одноцепочечных антител с уровнем экспрессии около 10% суммарного клеточного белка.

Полученный штамм депонирован в НИИ Коллекции культур микроорганизмов ГНЦ ВБ "Вектор" под номером В-716.

Сущность изобретения заключается в том, что для экспрессии гена одноцепочечного антитела его встраивают вместе с фрагментом, кодирующим лидерный пептид pelB, по EcoRI и HindIII сайтам в плазмиду pGEM1. В результате получают целевую плазмиду pTLS, содержащую ген одноцепочечного антитела против вируса клещевого энцефалита.

Экспрессию рекомбинантного одноцепочечного антитела осуществляют в клетках E.coli BL21 (DE3) с использованием индуктора ИПТГ. Индикацию экспрессии осуществляют с помощью белкового электрофореза и иммуноблоттинга. Рекомбинантный белок узнается антиидиотипическими антителами против исходного МКА E6B и взаимодействует с белком E вируса клещевого энцефалита. Уровень экспрессии определяют с помощью денситометрии полиакриламидного геля, окрашенного Кумасси-R250. Уровень экспрессии составляет около 10% суммарного клеточного белка.

Таким образом, впервые получена плазмидная ДНК и штамм-продуцент, обеспечивающие экспрессию одноцепочечных антител против вируса клещевого энцефалита в бактериальных клетках E.coli.

Изобретение иллюстрируется следующими фигурами:
Фиг. 1. Общая схема структурной организации плазмиды pTLS.

Vh и Vl - гены тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина, L - коннектор, pelB - фрагмент ДНК, кодирующий лидерный пептид, T7 - промотор фага T7, Ap^r - ген устойчивости к ампициллину; указаны некоторые сайты рестрикции.

Фиг. 2. Электрофореграмма лизатов клеток E.coli.

а. Окраска кумасси R-250. 1 - индуцированная культура клеток E.coli BL21(DE3)/pTLS, 2 - индуцированная культура клеток E.coli BL21(DE3)/pGEM1.

б. Иммуноблоттинг с антиидиотипическими антителами к МКА E6B. 1 - индуцированная культура клеток E. coli BL21(DE3)/pTLS, 2 - индуцированная культура клеток E.coli BL21(DE3)/pGEM1.

Фиг. 3. Иммунологический анализ одноцепочечных антител.

а. Взаимодействие поликлональных антиидиотипических антител к МКА E6B и клеточных лизатов в иммуноферментном анализе. На твердую фазу сорбировали клеточные лизаты BL21(DE3)/pTLS (1, 3) и BL21(DE3)/pGEM1 (2, 4) в разведениях. Разведение 1/100 соответствует 10 мкл клеточной культуры. Линии 1, 2 - взаимодействие с антиидиотипическими антителами, линии 3, 4 - взаимодействие с нормальной кроличьей сывороткой (использовалось разведение сывороток 1/200 и истощение их лизатом штамма BL21(DE3) в разведении 1/200).

б. Взаимодействие одноцепочечных антител из клеточных лизатов с рекомбинантным белком E. На твердую фазу наносили для сорбции 200 нг белка E, лизаты клеток BL21(DE3)/pTLS (1, 3) и BL21(DE3)/pGEM1 (2, 4) наносили в разведениях и проявляли антиидиотипическими антителами (1, 2) и нормальной кроличьей сывороткой (3, 4). Разведения сывороток и их истощение как в 3а.

в. Конкурентное связывание одноцепочечных антител из клеточных лизатов и МКА E6B с рекомбинантным белком E. На твердую фазу наносили для сорбции 200 нг белка E. Лизаты клеток BL21(DE3)/pTLS (1) и BL21(DE3)/pGEM1(2) наносили в разведениях, конкурирующие МКА E6B использовали в разведении 1/500000.

Для лучшего понимания сущности предлагаемого изобретения ниже следуют примеры его осуществления.

Пример 1. Способ конструирования плазмиды pTLS.

1.1. Сборка гена одноцепочечного антитела в единую ДНК-последовательность.

В качестве источника генов тяжелой и легкой цепей МКА E6B против вируса клещевого энцефалита используют плазмиды pMG-EH и pMG-EK [11], содержащие соответственно фрагмент гена тяжелой и фрагмент гена легкой цепей МКА E6B. По 50 мкг плазмиды pMG-EH и pMG-EK расщепляют рестриктазами XhoI, BstEII и SacI, HindIII соответственно в реакционной смеси, содержащей 50 mM трисHCl, pH 7.5; 10 mM MgCl₂; 50 mM NaCl и по 50 ед. активности соответствующих ферментов. Реакцию ведут 1 час при 37^oC. После этого фрагменты ДНК длиной 339 п. о. из XhoI, BstEII гидролизата плазмиды pMG-EH, содержащего ген вариабельного домена тяжелой цепи и длиной 332 п.о. из SacI-HindIII гидролизата плазмиды pMG-EK, содержащего ген вариабельного домена легкой цепи, выделяют методом электрофореза в полиакриламидном геле с последующей электроэлюцией.

Отдельно проводят отжиг двух пар олигонуклеотидов, кодирующих гибкий пептидный линкер (Gly₄Ser)₃, после чего лигируют их в стандартных условиях. Выделенные фрагменты генов тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина объединяют в единой реакционной смеси с 10-кратным избытком олигонуклеотидного коннектора и лигируют.

1.2. Конструирование рекомбинантной плазмиды pTLS.

Фрагмент ДНК, кодирующий лидер pelB, получают в полимеразной цепной реакции с Taq-ДНК-полимеразой, которую проводят в стандартном буфере при следующих условиях: I цикл - 94^oC, 1 мин, II цикл - 45^oC, 1 мин, III цикл - 72^oC, 1 мин с использованием праймеров и плазмиды pET(rF11) [5] в качестве матрицы. Фрагмент ДНК размером 220 п.о. выделяют методом электрофореза в полиакриламидном геле с последующей электроэлюцией. Затем обрабатывают его рестриктазами EcoRI и XhoI в стандартном буфере при 37^oC в течение 1 часа. Ферменты инактивируют прогреванием при 65^oC 20 мин.

Плазмидную ДНК pGEM1 обрабатывают рестриктазами EcoRI и HindIII, инактивируют ферменты нагреванием при 65^oC 20 мин, добавляют фрагмент ДНК, кодирующий лидер pelB, и фрагмент ДНК, содержащий ген одноцепочечного антитела. В стандартном буфере проводят лигирование. Полученной лигазной смесью трансформируют клетки E.coli JM 109. С помощью рестрикционного анализа отбирают клоны, содержащие вставку нужного размера. Полученную таким образом целевую плазмиду обозначают как pTLS. Схема плазмидной ДНК pTLS представлена на фиг. 1.

Пример 2. Характеризация рекомбинантного белка - одноцепочечного антитела против вируса клещевого энцефалита - продукта плазмиды pTLS.

Клетки E. coli BL21(DE3), несущие ген РНК-полимеразы фага T7 под индуцибельным lacUV5 промотором, трансформируют полученной плазмидой pTLS. Клетки E. coli BL21(DE3), трансформированные плазмидой pTLS, растят ночь при 37^oC. Ночную культуру (1/50) засевают в свежую среду YTx2 с ампициллином (50 мкг/мл). Синтез РНК-полимеразы индуцируют добавлением ИПТГ до концентрации 0.5 мМ в тот момент, когда культура достигает среднелогарифмической фазы роста. Индуцированные клетки растят ночь при 37^oC, после чего собирают центрифугированием при 5000 g и анализируют методом электрофореза по Лэммли в 12% SDS-полиакриламидном геле (ПААГ) и иммуноблоттинга с поликлональными антиидиотипическими антителами к МКА E6B. Результаты этого анализа, представленные на фиг. 2а, показывают наличие в индуцированной культуре клеток BL21(DE3)/pTLS дополнительного белка с молекулярной массой около 26 кДа, что соответствует расчетной молекулярной массе одноцепочечных антител (дорожка 1), который отсутствует в контрольном лизате клеток E.coli BL21(DE3)/pGEM1 (дорожка 2). Именно этот белок окрашивается в иммуноблоттинге с поликлональными антиидиотипическими антителами (АИА) (фиг. 2б).

Для дальнейших анализов клетки ресуспендируют в буфере ТE (50 mM трис-HCl, pH 8.0, 10 mM ЭДТА) и разрушают ультразвуком.

Сохранение правильной конформации антигенсвязывающего домена одноцепочечных антител исследуют в экспериментах по их связыванию поликлональными АИА, способными эффективно распознавать идиотипы исходных МКА E6B. Результаты иммуноферментного анализа (ИФА) демонстрируют способность поликлональных АИА к E6B взаимодействовать с рекомбинантными одноцепочечными антителами, содержащимися в лизатах клеток E.coli, несущих плазмиду pTLS (фиг.3а).

Способность одноцепочечных антител взаимодействовать с вирусным антигеном была продемонстрирована в ИФА с использованием рекомбинантного белка E вируса КЭ. Этот белок содержит домены E1 и E2 и эффективно связывается исходными МКА E6B. Результаты экспериментов показали способность полученных одноцепочечных антител взаимодействовать с белком E (фиг. 3б).

Для подтверждения идентичности эпитопа, распознаваемого МКА E6B и рекомбинантными антителами, был проведен конкурентный анализ между МКА E6B и полученными одноцепочечными антителами. Результаты подтвердили специфичность связывания рекомбинантных антител с белком E и показали наличие конкуренции между ними за общий сайт связывания (фиг. 3в).

Таким образом, впервые получены плазмидная ДНК и бактериальный штамм-продуцент, обеспечивающие экспрессию одноцепочечных антител против вируса клещевого энцефалита, сохраняющих конформацию вариабельного домена исходных МКА и способных взаимодействовать с доменом E2 поверхностного гликопротеина вируса клещевого энцефалита. Участие этого домена во взаимодействии вирусной частицы с клеточным рецептором на ранних стадиях проникновения вируса КЭ в клетку позволяет рассчитывать на то, что полученные одноцепочечные антитела смогут блокировать вирусную инфекцию. Эти результаты являются первым этапом работы по созданию лекарственных средств нового поколения против вируса клещевого энцефалита.

ЛИТЕРАТУРА
1. Hauschield J. , Faro H. P,. Pack P., Pluckthun A. Pharmacokinetic properties of bivalent miniantibodies and comparison to other immunoglobulin forms. // Antibody Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals. -1995. -Vol. 8. -P. 111-129.

2. Yokota Т., Milenic D.E., Whitlow M., Schlom J. Rapid tumor penetration of a single-chain Fv and comparison with other immunoglobulin forms. // Cancer Res. - 1991.- Vol. 51. -P. 6363-6365.

3. Schier R., Bye J., Apell G., et al. Isolation of high-affinity monomeric human anti-c-erbB-2 single-chain Fv using affinity-driven selection. // J.Mol.Biol. - 1996. - Vol. 255. - P. 28-43.

4. Hu S., Shively L; Raubitschek A.; et.al. Minibody: A novel engineered anticarcinoembryonic antigen antibody fragment (single-chain Fv-CH3) which exhibits rapid, high-level targeting of xenografts. // Cancer Res. - 1996. - Vol.56. - P. 3055-3061.

5. Беспалов И. А., Шиянов П. А., Лукашевич Л. В. и др. Получение одноцепочечных антител к ферритину человека в клетках Escherichia coli. // Мол. биол. - 1995. - Т. 27. - С. 451-460.

6. Condra J.H., Sardana V.V., Tomassini J.E., et al. Bacterial expression of antibody fragment that block human rhinovirus infection of cultured cells. // J. Biol. Chem. 1990. - Vol.265. - P. 2292-2295.

7. Jiang W., Bonnert T.P., Venugopal K., Gould E.A. A single chain antibody fragment expressed in bacteria neutralizes tick-borne flaviviruses. // Virology. - 1994. - Vol.200. - P. 21-28.

8. Протопопова E. В., Хусаинова А.Д., Коновалова С.Н., Локтев В.Б. Получение и изучение свойств антиидиотипических антител, несущих на своей поверхности гемагглютинирующие паратопы вируса клещевого энцефалита.// Вопр. вирусол. - 1996. - N 2. - С. 50-53.

9. Протопопова Е. В., Коновалова С. Н., Локтев В. Б. Выделение клеточного рецептора для вируса клещевого энцефалита при помощи антиидиотипических антител. // Вопр. вирусол. - 1997. - N 6. - С. 264-268.

10. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. (Maniatis Т., Fritsch Е.Е., Sambrook J. Molecular cloning. Cold Spring Harbor Laboratory. N. Y.: Cold Spring Harbor 1982.)
11. Николенко Г.Н., Голован С.Я., Ильичев А.А., Тикунова Н.В. Клонирование и секвенирование гена, кодирующего одноцепочечный иммуноглобулин на поверхностный гликопротеин E вируса клещевого энцефалита. // Журнал инфекционной патологии - 1996. - Т.3. - С. 47-52.

Изобретение относится к биотехнологии, генной и белковой инженерии. Получение одноцепочечных антител против вируса клещевого энцефалита осуществляют путем встройки в плазмидный вектор рGEM1 фрагмента ДНК, кодирующего лидерный пептид пектиназы В (реlB) Erwinia carotovora, и генов вариабельных доменов МКА Е6В против вируса клещевого энцефалита в составе единой ДНК-последовательности. Сконструированная рекомбинантная плазмидная ДНК рTLS обеспечивает экспрессию одноцепочечных антител против вируса клещевого энцефалита в клетках бактерий Е.coli. Полученные химерные антитела сохраняют конформацию вариабельного домена исходных МКА и способны взаимодействовать с доменом Е2 поверхностного гликопротеина вируса клещевого энцефалита. Предложен рекомбинантный штамм бактерий Е.coli В-716 - продуцент одноцепочечных антител против вируса клещевого энцефалита, которые могут быть использованы для создания лекарственных средств нового поколения против вируса клещевого энцефалита. 2 c.п. ф-лы, 3 ил.

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pTLS, содержащая ген одноцепочечного антитела против вируса клещевого энцефалита молекулярной массой 2,5 Md и размером 3782 п.о., содержащая: плазмидный вектор pGEM1, раскрытый по EcoRI и Hind. III - сайтам и содержащий сайт инициации репликации плазмиды PUC18, промотор фага Т7 и уникальные сайты рестрикции EcoRI (969), Hind III (7), Pvu I (2483), Pvu II (1015), SphI (3350), BglI (2195), Aat II (3006); Xho I - BstE II - фрагмент размером 339 п.о., представляющий собой ген вариабельного домена тяжелой цепи моноклонального антитела E6B против вируса клещевого энцефалита; Sac I - Hind III - фрагмент размером 332 п.п., представляющий собой ген вариабельного домена легкой цепи моноклонального антитела E6B против вируса клещевого энцефалита; синтетический BstE II - Sac I коннектор размером 71 п.о., кодирующий линкерный пептид (Gly₄Ser)₃; EcoR I - Xho I - амплификационный фрагмент размером 220 п.о., содержащий регуляторные элементы и первые 22 триплета гена пектатлиазы B Erwinia carotovora ; генетические маркеры: bla - ген ампициллин резистентности (ген β-лактамазы), определяющий устойчивость к ампициллину при трансформации Escherichia coli. 2. Штамм бактерий Escherichia coli B-716 - продуцент одноцепочечных антител против вируса клещевого энцефалита.