ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS MUSCULUS L. - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ, СПЕЦИФИЧНЫХ К ПРЕПАРАТУ БЕЛКОВ БРУЦЕЛЛ С МОЛЕКУЛЯРНЫМ ВЕСОМ 18 И 38 КД Российский патент 1998 года по МПК C12N5/12 C12N5/18 C12P21/08 

Изобретение относится к гибридной технологии и может быть использовано в ветеринарии и медицине при диагностике бруцеллеза.

Известны штаммы гирбидомных культивируемых клеток животных Mus musculus L. , продуцирующих моноклональные антитела (Мон АТ) к бактериям рода бруцелл (а. с. СССР 1604848; а.с.СССР 1604849). Наиболее близким по технической сущности является штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. -ВСКК (II) N 303ДБ продуцирующих Мон АТ IgG подкласса 2а, специфичные к эпитопу "кор" полисахаридной цепи бруцелл (а.с.СССР 1604848). Недостатком указанного штамма гибридом и продуцируемых ими антител является невысокая стабильность продукции антител в организме животных, отсутствие взаимодействия с бруцеллами B. Suis, B. rangiferi, B.neotomae. Задачей изобретения является получение гибридомы - продуцента моноклональных антител, пригодных для определения белковых антигенов бруцелл.

Штаммы гибридомы получают путем введения внутрибрюшинно мышам линии BALB/c убитой нагреванием культуры бруцелл штамма B abortus 19BA. В первый день иммунизации вводят 5•10⁹ микробных клеток (м.к.), на восьмые сутки - 10⁹ м. к. в 0,2 мл физиологического раствора. Через 3 суток извлекают селезенку мыши и проводят гибридизацию 3•10⁶ спленоцитов мыши с 3•10⁵ клетками миеломной линии РЗ-Х63 Ag/8-6.5.3 в присутствии 1 мл 50% раствора полиэтиленгликоля с молекулярным весом (мол.вес) 1500 в течение 1 мин.

После отмывки полиэтиленгликоля клетки высевают на 96-луночные планшеты на слой перитонеальных макрофагов, взятых у мышей линии BALB/c. Селекцию гибридных клеток проводят на селективной среде с содержанием гипоксантина-аминоптерина-тимидина (HAT). Через 21 сутки из среды убирают аминоптерин. В последующем культивировании проводят на среде PPMI-1640 "Flow" с добавками. Клонирование проводят методом лимитирующих разведений в 96-луночных планшетах на слое перитонеальных макрофагов.

Морфологическая характеристика. Культура гибридных клеток состоит из слабоприкрепленных к подложке округлых клеток с размером с исходную миеломную клетку.

Культуральные свойства. Культивирование штамма гибридомы ведут при температуре 37^oC в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Средой культивирования является среда PPM1-1640 "Flow", содержащая 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ/L-глутамина, 8-10 мМ раствора Hepes, 50 мкг/мл гентамицина. Клетки культивируют в виде стационарной суспензии в пластиковых матрацах "Flow" или пластиковых чашках "Петри" отечественного производства. Пассирование клеток гибридомы проводят 2 раза в неделю с кратностью разведения 1:2 - 1:3. Посевная концентрация клеток составляет 2-3•10⁵ в 1 мл среды. Максимальная концентрация гибридных клеток при культивировании составляет 9•10⁵ на 1 мл среды. Гибридный клон не теряет способности синтеза антител при 60 пассажах in vitro (срок наблюдения).

Культивирование гибридомы в организме животного. Вид животного - инбредные мыши линии BALB/c. Доза клеток при прививке составляет 5•10⁶ - 10⁶ на одну мышь. За 14 суток до введения клеток гибридомы, мышам внутрибрюшинно вводят 0,5 мл 2, 6, 10, 14-тетраметиленпентадекана (пристана), а за сутки - 0,5 мл полного адъюванта Фрейнда. Иммуноасцитическая жидкость образуется на 14-20 сутки в объеме 3-5 мл. Перевиваемость клеток на животных не исследовалась.

Синтез иммуноглобулина, продуцируемого гибридомой, определяют методом иммуноферментного анализа (ИФА). Гибридома продуцирует специфические антитела к бруцеллам, титр которых составляет в культуральной жидкости (КЖ) 1:160, в иммуноасцитической жидкости (ИАЖ) 1:128000.

Характеристика полезного продукта. Гибридома синтезирует моноклональные антитела (МонАТ), относящиеся к lgG класса. Они специфичны к белковому бруцеллезному препарату (ББП) с мол.весом белков 18+38 кД, E.coli CSU, полученному генно-инженерным способом.

Специфичность МонАТ проверяют ИФА с целыми клетками бруцелл: B. suis, B. abortus, B. melitensis, B. rangiferi, B. neotomae белками бруцелл мол.весом 18+38 кД и в реакции иммунодиффузии в геле (РИД) с растворимыми антигенами бруцелл: липополисахаридом (ЛПС) и белково-полисахаридным антигеном (БПА) из штамма B. abortus 19BA и ББП (18+38 кД). Результаты исследования представлены в табл.1, 2.

Оценку результатов производят визуально и оценивают в крестах:
4 (4 креста) - резкоположительный
3 (3 креста) - выраженный
2 (2 креста) - положительный
- (минус) - отрицательный
Данные таблиц показывают, что МонАТ ГБ-2АН10 специфически взаимодействуют с ИФА с бактериальными клетками бруцелл и ББП (18+38 кД). РИД показывает, что МонАТ образуют полосу преципитации с ББП (18+38 кД) и не образуют таковую с ЛПС и БПА бруцелл.

Таким образом, установлено, что МонАТ ГБ-2АР10 взаимодействуют с бруцеллами, ББП (18+38) кД в ИФА, а в РИД образуют полосу преципитации с ББП (18+38 кД), но не образуют преципитата c ЛПС и БПА бруцелл. Данные свидетельствуют, что МонАТ получены к белковым антигенам бруцелл мол. весом (18 + 38 кД).

Контаминация штамма. Контаминанты гибридной линии, включая бактерии, дрожжи, грибы нее выявлены. Микроплазмы не определяли.

Криоконсервация. Среда замораживания содержит PPМI-1640 - 40%, эмбриональной телячьей сыворотки - 50%, глицерола - 10%.

Режим криоконсервации и отогрева. После запаивания ампул с гибридными клетками, проводят эквилибрацию при температуре 6-8^oC в течение 4 ч, затем ампулы выдерживают в парах азота в течение 18-20 ч, после чего опускают в жидкий азот.

Размораживание проводят быстро на водяной бане при 37^oC.

Ампулы содержат 0,7-1,0 мл криозащитной среды с концентрацией гибридных клеток 5•10⁶ - 10⁶. Жизнеспособность восстанавливаемых гибридом после криоконсервации составляет 65-75%. Клетки замораживают на 40 пассаже.

Использование штамма ГБ-2АН10.

Пример. Для проведения непрямого варианта ИФА на полистироловую панель (96 лунок) для микротитрования сорбируют 0,025 мкл суспензии бруцелл, приготовленной на 0,01 М фосфатном буфере pH 7,2 в концентрации 10⁹ микробных клеток в 1 мл, после чего добавляют по 25 мкл 0,25% глутаральдегида и помещают в термостат при температуре 37^oC на 3-4 ч, затем выдерживают при 6-8^oC в течение 18-20 ч. Панель отмывают забуференным физиологическим раствором (ЗФР), содержащим 0,05% Твина-20. Вносят в лунки 0,5% раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА), проверенного на отсутствие пероксидазной активности, в объеме 100 мкл и выдерживают при температуре 37^oC 45 мин. Готовят разведение супернатанта КЖ, начиная с 1:10 и выше, ИАЖ с 1:100 и выше и вносят в панель в объеме 25 мкл. Панель инкубируют при 37^oC в течение 2 ч. После этого панель отмывают раствором ЗФР-Твин трижды вносят антитела против иммуноглобулинов мыши, меченные пероксидазой хрена в рабочем разведении. Панель выдерживают при температуре 37^oC, затем трижды отмывают раствором ЗФР-Твин и 5 раз прополаскивают деионизованной водой с сопротивлением 0,5 Мом/см. Положительную реакцию оценивают визуально по появлению желто-коричневого окрашивания продуктов распада H₂О₂ в присутствии хромогена-ортофениплендиамина. При необходимости реакцию останавливают добавлением в лунки 8N серной кислоты.

Преимущества штамма гибридомы ГБ-2АН10 по сравнению со штаммом гибридомных культивируемых клеток животных Mus musculus L СКК (II) N 302Д: стабильность продукции антитела (гибридома не теряет способности синтезировать антитела в наблюдаемых 60 пассажах).

МонАТ гибридомы ГБ-2АН10 взаимодействуют с ИФА с представителями бруцелл: B. suis, B.melitensis, B. abortus, B. rangiferi. и ББП (18+38 кД) и не взаимодействует с ЛПС и БПА бруцелл, тогда как в прототипе МонАТ (а.с. 1604848) взаимодействуют только с бруцеллами видов: B. abortus, B. melitensis, а также с их ЛПС.

Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей линии Balb/c, иммунизированных убитыми нагреванием клетками бруцелл. Штамм продуцирует моноклональные антитела (МКА) изотипа IgG. Они специфичны к препарату белков бруцелл с мол. весом 18 и 38 кД, полученных генноинженерным методом. Титр МКА в культуральной жидкости составляет 1 : 160, в асцитной 1 : 128000. МКА могут быть использованы для диагностики бруцеллеза. 2 табл.

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. ГБ 2АН10 - продуцент моноклональных антител, специфичных к препарату белков бруцелл с молекулярным весом 18 и 38 кД.