Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L. - продуцент моноклональных антител к бактериям рода BRUceLLa Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 

ИзобретеНие относится к гибридом- ной технологии и может быть использовано в ветеринарии и медицине при диагностике бруцеллеза.

Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых леток животных Mus muscnlus L., продуцирующих моноклональные антите- тела (МонАТ) к кор липосахариду бруцелл.

итамм получают следующим образом Мышам линии BALB/c в первый день иммунизации внутрибрюшинно вводят 30 мкг полисахаридного антигена - поли-Б,- пол ченного из R-формы Brucella melitensis шт.В-115, в 0,1 МП неполного адъюванта Срейнда ЦОЛИ-Б из R-форм бруцелл не содержит 0-специфическ1то Цепь липополиса- харида (ЛЦС) и состоит из липвда А

кор части полисахарида. На 11, 12 и 13 дни иммунизации животым инъецируют по 15 мкг антигена в абуференном физиологическом раствое (ЗФР), рН 7,2-7,3. Спустя четьфе ня после последней инъекции, извлекают селезенку тех мьшей, которые дают более высокие титры антител по твердофазному иммуноферментному анализу (ТИФА). Клетки селезенки иммунных мышей в количестве 7,5 к 1,0 гиб- ридизуют с 1,5 X 10 клетками миело- мы X 63Ag 8-6.5.3 в присутствии 1 мл раствора, содержащего 45% полиэтилен- гликоля 4000 и 10% диметилсульфокси- да в течение 1 мин. После гибридизации и отмывки клеток от полиэтилен- гликоля высевают их в ячейки 96-лу- ночной панели на слой перитонеальных макрофагов мыши.

Селекцию гибридных клеток проводят на среде, содержащей гипоксаитин- аминоптерин-тимидин.. Гибриды - продуценты клонируют два раза методом лимитирующих разведений, высевая в ячейки 96-луночной панели с питающим слоем перитонеальных макрофагов. После второго клонирования практически 100% субклонов продуцируют антитела к тестируемому антителу. Продуктивный клон гибридомы обозначают БШ1А.

Штамм БИМА хранится в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК (И) № ЗОЗД и характеризуется следующими свойствами.

Морфологическая характеристика. Культура состоит из слабоприкрепляющихся к подложке округлых клеток размером с исходную миеломную клетку. Цитоплазма имеет вид тонкого ободка вокруг ядра.

Культуральные свойства. Среда культивирования - среДа RPM1-1640 с 10%-ной эмбриональной сывороткой теленка, 2 х10-з м глюта- мина, 1 X 10- пирувата натрия,5х X 2-меркаптоэтанола, 1 х 10 М HepeS, 50 мкг/мл гентамицина. Культивирование штамма ведут при 37,5°С в атмосфере с 5% СО. Характер роста - стационарная суспензия. Частота пассирования - через 2-3 сут, кратность рассева 1-.3-1 :4 . Посевная концентрация клеток 1-2 х 10 в 1 мл. Максимальная клеточная плотность 0,5 мпн/мл.

. Культивирование in vivo.

При внутрибрюшинной прививке мышам линии ВА1Б/С штамм гибридомы образует опухоль в асцитной форме на 9-11 дни. Доза клеток при прививке 2 X 10 кл. За 7 дней до введения гибридомы необходимо инъе цировать. животным пристан - 2, 6, ТО, 14 - тетраметилпентадекан в дозе 0,5 мл на головку. Штамм сохраняет способность продуцировать специфические моноклональные антитела в течение 5 пассажей на сингенных мьшах (время наблюдения).

Продуктивность штамма. На 3-4 день культивирования гибридомы концентрация МТ(А составляет 45-50 мкг/мл в культуральной среде и 8 мг/мл в очищенной асцитной жидкости. Характеристика полезного продукта, МонАТ относятся к классу IgG подклассу 2а. Они специфичны к эпитопу

кор участка полисахаридной цепи 5 бруцелл. Константа связывания 7,7 х X .

Методы оценки специфичности МонАТ: непрямой и сэндвич варианты ТИФА, иммуноблот, реакция микроагглютйна- Q ции (РМА) .

Контаминация. Контаминантов линии, включая бактерий, грибы, дрожи и микоплазму, не обнаружено.

Криоконсервация. К осадку гибридных клеток добавляют эмбриональную сьгоорртку теленка, а затем - димётил- сульфоксид до конечной концентрации 10%. Суспензию клеток разливают в стерильные пластиковые ампулы с за- винчиваюш 1ми крышками по 1-5 млн.кл. в объеме 1 мл, помещают в коробку из пенопласта и оставляют на 1. сут при -70°С, после чего ампулы переносят в жидкий азот. Замороженные ампулы вынимают из сосуда с жидк им азотом и быстро.помещают в водяную баню на 37°С. Как только растают последние кусочки льда, суспензию клеток пере- носят стерильной пипеткой в центрифужную пробирку, содержащую 10 мл холодной бессывороточной среды, отмывают один ра.з и засевают в ячейки 24- луночной панели с питаюш 1м слоем пе- ритонельных макрофагов мышей.Число жизнеспособных клеток после размора- живания не менее б2%.

50

Штамм БИМА используют образом.

следующим

516

Пример 1. Гибридные клетки помещают в пластиковый флакон площадью 25 см по 5x10- в 5 мл среды культивирования и инкубируют 3-4 дня при 37,5 С в атмосфере, содержащей 5% СО. Культуральную среду собирают, центрифугируют 10 мин при SOOg и 4 С с целью отделения клеток от на- досадочной жидкости - супернатанта, содержащего антитела. При культивировании гибридомы in vivo иммуноглобули- новую фракцию из асцитной жидкости получают высаливанием белков сульфатом аммония до 45% насыщения с по

следующим диализом против ЗФР/рН 7,2-7,3 при 4 С в течение ночи. Полученные антителосодержащие материалы: супернатант и очищенную асцитную жидкость используют как реагенты для изучения специфичности взаимодействия МонАТ с тестируемыми антигенами.

П р и м е р 2. Дпя проведения непрямого варианта ТИФА на полисти0

5

ции Б течение 1,5 ч при панель отмывают описанным способом и вносят в ячейки антитела кролика против им- муглобулинов мьшш, конъюгированные с пероксидазой хрена. Через 1 ч повторяют процедуру отмьшки с целью удаления несвязанных продуктов реакции, а связавшийся конъюгат, а значит и антитела против антигена бактерий определяют количественно по распаду субстрата - в присутствии хро- . .могена-ортофенилендиамина. Положи- . тельная реакция характеризуется корич- невым окрашиванием и просчитывается при 492 нм.

Результаты опыта по определению активности иммуноглобулинов из куль- туральной среды и асцитной жидкости представлены в таблице.

Данные таблицы показывают, что в непрямом варианте ТИФА моноклональные антитела, продуцируемые штаммом гиб

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано в ветеринарии и медицине при диагностике бруцеллеза. Цель изобретения - получения штамма гибридных культивируемых клеток животных MUS MUSCULUS L., продуцирующих моноклональные антитела (МонАт) к "кор" липосахариду бруцелл. Штамм получают гибридизацией клеток селезенки мыши линии BALB/с, иммунизированных полисахаридным антигеном из R-формы BRUCELLA MELITENSIS, с клетками миеломмы X63AG8-6.5.3. Штамм депонирован под номером ВСКК/П/ N 303D. Среда культивирования клеток - среда RPMI-1640 с 10% эмбриональной сывороткой теленка, 2^.10^-3 М глютамина, 1^.10^-3 пирувата натрия, 5^.10^-5М 2-меркаптоэтанола, 1^.10^-2М HEPES. 50 мкг/мл гентамицина. Культивирование ведут при 37°С в атмосфере с 5% CO₂. Частота пассирования через 2-3 сут, кратность рассева 1:3-1:4. На 3-4 день культивирования гибридомы концентрации МонАТ составляет 45-50 мкг/мл в культуральной среде и 7 мг/мл в очищенной асцитной жидкости. монАТ относятся к классу JGG, подклассу 2а и специфичны к эпитому "кор" участка полисахаридной цепи бруцелл. 1 табл.

рольную 96-луночную панель для микро- 25 БИМА, реагируют со всеми иститрования. сорбируют антигены: липо- полисахариды и поли-Б Brucella abortus, Brucella meliten si s „ J. ente- rocoli tica 0:9 (1 мкг в 100 мкл ЗФР, рН 7,2-7,3) при 4°С в течение ночи. Затем панель отмывают три раза ЗФР и три раза ЗФР с 0,05%-ным Тви- ном-20 (ЗФР-Тв), готовят в ячейках панели двукратные разведения супер-- натанта (1:2 и выше) и очищенной асцитной жидкости (1:100 и выше) в объеме 100 мкл ЗФР-Тв. После инкуба30

пользованными бактериальными антигенами, в том числе с липополисахари- дами J.enterocolitica 0:9, имеющими аналогичную химическую структуру с ЛПС бруцелл.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L - . ВСКК(П) № ЗОЗД - продуцент монокло- 35 нальных антител к бактериям рода Brucella.

Поли-Б Brucella melitensis В115

Поли-Б Brucella melitensis 16М

ЛПС Brufcella abortus 19

ЛПС Brucella abortus 54

ЛПС Brucella melitensis 16М .

ЛПС J.enterocolitica 0:9

25 БИМА, реагируют со всеми ис30

пользованными бактериальными антигенами, в том числе с липополисахари- дами J.enterocolitica 0:9, имеющими аналогичную химическую структуру с ЛПС бруцелл.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L - . ВСКК(П) № ЗОЗД - продуцент монокло- 35 нальных антител к бактериям рода Brucella.

1:819 200 1:204 800 V:204 800 1:204 800 1:409 600 1:204 800