Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L., продуцирующий моноклональные антитела к бактериям рода BRUceLLa Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 C12P21/08 

Изобретение относится к гибридом- ной технологии и может быть использовано в ветеринарии и медицине при диагностике бр уцеллеза.

Целью изобретения является получение гибридомы-продуцента монАТ, пригодных для дифференциации бактерий рода Brucella и не дающих перекрестных реакций с бактериями Yersinia eo terocolitica серовара 0:9.

Штамм гибридомы получают следующим образом.

.Мышам линии BALB/c в первьй день иммунизации внутрибрюшинно вводят полисахаридный антиген. - поли-Б, полученный из R-форм Brucella meliten- sis ВП5 в дозе 30 мкг в О, 1 мл неполного адъюванта Фрейнда. Поли-Б из R-форм бруцелл не содержит 0- антигена ЛПС и состоит из липида А и сердцевинноГ) (кор) части бактери-. ального полисахарида. На 7, 11, 12 и 13 дни иммунизации животным инъецируют по 15 мкг антигена в забуО5

о

4

00

со

ерейном физиологическом растворе (ЗФР). Спустя 4 дня после последней нъекции, извлекают селезенку тех ышей, которые дают более высокие

титры антител К поли-Б антигену по твердофазному и ммуноферментному анаизу. Спленогщты иммунных мышей в количестве 7,5 х 10 гибридизуют с 1,5 X 10 клетками миеломы X 63 Ag JQ 8-6.5.3. в присутствии 1 мл раствора, содержащего 45% полиэтиленгликоля с молекулярной массой 4000 и 10% ди- метилсульфоксида в течение 1 мин. После гибридизации и отмывки кпеток 15 от полиэтиленгликоля высевают их в ячейки 96-луночной панели на олой перитонеальных макрофагов мьшш.

Селекцию гибридных клеток проводят на среде, содержащей ГАТ-гипоксан-20 тин-аминоптерин-тимидин, Гибриды- продуценты .клонируют два раза методом предельных разведений, высевая в ячейки 96-луночной панели с питающим слоем перитонеальных макрофагов. 25 После второго клонирования практически 100% субклонов продуцируют антитела к тестируемому антигену. Продуктивный клон гибридных клеток (гиб- ридомы) обозначают БАМА-Бруцелла Q

Абортус Моно-кловальное Антитело.

Штамм гибридомы БАМА хранится в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР, под номером ВСКК/П/302 Д и характеризуется следующими свойствами.

Морфологическая характеристика. Культура состоит из слабоприкреплл- ющихся к подложке округлых клеток д

размером с исходную миеломную клетку. Ядро занимает большую часть клетки. Цитоплазма имеет вид тонкого ободка.

Культуральные свойства. Средад

культивирования - среда RPMI-1640 с 10% 5,мбриональной сывороткой теленка, 2 X -Ю М глютамина, 1 х X М пирувата натрия, 5 х 10 М 2-меркаптоэтанола, 1 х Ю .МНЕРЕБ, 50 мкг/мл гентамицина. Культивирование штамма ведут при 37,5,С в атмосфере с 5% СО. Характер роста - стационарная суспензия. Частота пасси- вирования - через 2-3-сут, крат-.

ность рассева 1:3-1:4. Посевная кон- центрация клеток 1-2 х 10 в 1 мл. Максимальная клеточная плотность 0,5 млн/МП.

50

.

0

При внутрибрюшинной прививке сип- генным мышам штамм гибридомы образует опухоль в асцитной форме на 10- день. Доза клеток при прививке 2 X 10 кл. За 7 дней до введения гибридомы необходимо инъецировать животным пристан - 2, 6, 10, 14 - тетраметилпентадекан в дозе 0,5 ми на мышь. Штамм сохраняет спрсобность продуцировать специфические монокло- нальные антитела в течение 5 пассажей на сингенных мышах (время наблюдения) .

Продуктивность штамма. Гибридные клетки помещают в пластиковый флакон площадью 25 см по5х10в5мл среды культивировани я, инкубируют 3-4 дня при 37,5 С в атмосфере, содержащей 5% С02. Культуральную среду собирают, центрифугируют 10 мин при 800 g и 4 с с целью отделения кпеток от надосадочной жидкости - суперна- танта, содержащего антитела. На 3-4-й день культивирования гибридомы концентрация монАТ достигает 35-45 мкг/мл i вкультурапьной среде.

При культивировании гибридомы in vivo иммуноглобулиновую фракцию из асцитной жидкости получают высаливанием белков сульфатом аммония до 45% насыщения с последующим диализом против ЗФР (рН 7,2-7,3) при 4 с в течение ночи. Полученные антителосодер- жащие материалы: супернатант и очищенную асцитную жидкость с конечной концентрацией иммуноглобулинов 8 мг/мп : используют как реагенты для излучения специфичности взаимодействия монАТ с тестируемыми антигенами с помощью РМА и ТИФА.

Характеристика полезного продукта, МонАТ относятся к классу IgG,, подклассу 2а. Они специфичны к зпитопу кор части полисахариДной цепи ЛПС бруцелл. Константа связывания 0,6 х X 10 М.

Методы оценки специфичности МКА: реакция микроагглютинации - (РМА) и твердофазный иммуноферм нтный анализ (ТИФА).

Контаминация штамма. Контаминантов . линии, включая бактерии, грибы, дрожжи и микоплазму, не обнаружено.

Криоконсервация. К осадку гибридных клеток добавляют. эмбриональную сыворотку теленка, а .за тем диметил- сульфоксид до конечной концентрации --,,10%. Суспензию клеток разливают в

стерильные пластиковые ампулы с за- винчивaющи шcя крышками по 1-5 млн кл в объеме 1 мл, помещают в коробку из пенопласта и оставляют на 1 сут при 70°С, после чего ампулы переносят в жидкий азот. Оттаивание: замороженную ампулу быстро помещают в водяную баню на 37°С. Как только растают последние кусочки льда, суспензию гибридомы переносят стерильной пипеткой в центрифужную пробирку, содержащую 10 мп холодной бес- сыворочной среды, отмывают один раз и засевают в ячейки 24-луночной панели с питающим слоем перитонеальных макрофагов. Число жизнеспособных клеток после размораживания не менее 73%

П р и м е р- 1 . Исследование взаимодействия монАТ БАМА в реакции микроагглютинации (РИА) с различными видами и штаммами бактерий рода Brucel- 1а, а также с бактериями Yersinia enterocolitica 0:9, Escherichia coli, Campylobacter fetus veneralis.

PMA проводят в ячейках 96-луночной панели для микротитрования. В первую ячейку вносят 50 мкл неразведенного супернатанта, а с второй по восьмую ячейки - его двукратные разведения. Очищенную асцитную жидкость рас- титровывают в 16 ячейках, начиная с 1:100, В качестве буфера для раз- ведения используют ЗФР, рН 7,2-7 3. Затем в каждую ячейку вносят по 5 мкл суспензии бактериальных клеток в кон-- центрации 1 х кл/мл. Результаты реакции учитывают под световым микроскопом или визуально через 2ч инкубации при 37°С.

Полученные данные свидетельствуют о высокой специфичности монАТ БАМА к бактериям рода Brucella и отсутст- зии перекрестной реактивности с бактериями Y. enterocolitica, E.coli, Campylobacter fetus veneralis.

П p и M e p.2. Исследование взаимодействия монАТ с очищенными полисахаридными aнтигeнa и (ЛПС и ) из различных видов и штаммов бактерий рода Brucella и Yersinia enterocolitica 0:9, в иммунофермен- тативном анализе.

На полистирольную 96-луночную анель для Микротитрования сорбируют олисахаридные антигены (липополи- ахариды и поли-Б) Brucella и Yerinia enterocolitica 0:9 в концентраии 1 мкг/мл в 100 мкл ЗФР ()И 7,2- ,3), инкубируя при в течение

16

1604849

ночи. Панели отмывают три раза ЗФР и три раза ЗФР с 0,05% Твином-20 (ЗФР-Тв), а затем в ячейки панели вносят двукратные разведения культу- { ральной среды или очищенной асцитной жидкости в количестве 100 мкл и инкубируют в течение 1,5 ч при З7 с. Панель отмывают описанным способом Q и вносят в ячейки антитела кролика против иммуноглобулинов мыши, кова- лентно связанные с пероксидазой хрена. После окончания инкубации.(1ч, 37 С) повторяют процедуру отмывки с целью удаления несвязанных продуктов реакции, а связавшийся конъюгат определяют количественно по расщеплению субстрата , в присутствии хромогена-ортофенилендиамина. Поло- 20 житейьная реакция характеризуется коричневым окрашиванием и учитывается спектрофотометрически при длине волны 492 нм.

Результаты опыта по определению 25 специфичности связывания иммуноглобулина из культуральной и очищенной асцитной жидкости в ТИФА показывают, что монАТ в наибольшем разведении (1:12800) реагируют с антигеном Q поли-Б из клеток Brucella melitensis

35

В-115, который лишен 0-цепи ЛПС и состоит в большей части из участка полисахарида. Таким образом именно к последнему специфичны монАТ БАМА.

Аналогичные эпитопы обнаружены антителами БАМА в ЛПС Brucella abortus .

Пример 3. Использование монАТ БАМА в качестве 1-го :лоя на твердой фазе в ИФА на выявление антигенов Brucella в испытуемом материале.

На полистирольную 96-луночную панель для микротитрования сорбируют монАТ (20 мкг в 1 мп), очищенные высаливанием сульфатом аммония, в 100 мкл бикарбонатного буфера (рН 9,5) при в течение ночи. Затем .панель отмывают по три раза ЗФР и ЗФР-Тв, вносят в ячейки 100 мкл полисахаридного антигена в концентрации 1 мкг/МП в ЗФР-Тв и инкубируют 1,5 ч при 37 С. Панель отмывают описанным способом,готовят в ячейках двукратные разведения поликлональной 5 сыворотки крупного рогатого скота в ЗФР-Тв (1:1000 и выше), имеющей равные титры антител против использованных видов бруцелл и иерсишш по РМА и ТИФА. После вьщерживания па /

716048498

нели при 37°С в течение 1 ч повто-.рий рода Brucella от Yersinia ente- яют процедуру отмывки и в ячейкиrocolitica серовара 0:9, и может

вносят антитела против иммуноглобу-быть использован в разработке специлинов быка, меченные пероксидазой.фических методов диагностики бруцелКонцентрацию связавшихся антител оп-леза. ределяют по примеру 3.

Результаты изучения специфичное-Формула изобретения

ти монАТ в сэндвич варианте ТИФА

согласуются с данными предьщущих Штамм гибридных культивируемых

примеров.клеток животных Mus musculus L.

Штамм гибридных клеток БАМА про- ВСКК(П) № 302Д, продуцирующий монодуцируют моноклональные антитела,клональные антитела к бактериям рода

позволяющие дифференцировать бакте- -Brucella.

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано в ветеринарии и медицине при диагностике бруцеллеза. Цель изобретения - получение гибридомы - продуцента монАТ, пригодных для дифференциации бактерий рода BRUCELLA и не дающих перекрестных реакций с бактериями YERSINIA ENTEROCOLITICA серовара 0:9. Штамм БАМА депонирован под номером ВСКК(П)302Д. Штамм сохраняет продуцирующую способность в течение 5 пассажей на сингенных мышах. Выход монАТ на 3-4 день культивирования в среде составляет 35-45 мкг/мл, IN VIVO - 8 мг/мл асцитной жидкости. Продуцируемые штаммом монАТ относятся к классу JGG, подклассу 2а

специфичны к эпитопу "кор" части полисахаридной цепи ЛПС бруцелл. 1 табл.