Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L. - продуцент моноклональных антител к бактериям рода BRUceLLa Советский патент 1992 года по МПК C12N5/00 

со С

Использование: биотехнология, ветеринария, медицина. Сущность изобретения: штамм получают гибридизацией спленоци- тов мышей линии Balb/c с клетками миело- мы Х63-Ад 8-653. Продуктивность штамма достигает 35-45 мкг/мл в культуральной жидкости и 7-8 мг/мл в асцитной. Монокло- нальные антитела (МКА) направлены к белку внешней мембраны бактерий рода Bruceila смол.м. 14 кД. МКА относятся к классу lgG1. Штамм обозначен СзН4 и хранится под номером ВСКК(П) 518Д. 2 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к гибридомной технологии, касается получения моноклональных антител (МКА) к антигенам бактерии рода Bruceila и может быть использовано в ветеринарии и медицине при разработке средств диагностики и профилактики бруцеллеза.

Известны штаммы гибридных клеток (гибридом), вырабатывающие МКА к 0-цепи липополисахарида (ЛПС) бруцелл, которые является хорошо изученным антигеном гра- мотрицательных бактерий.

Имеются также штаммы гибридом - продуцентов МКА против кор участка пол- исахаридной молекулы бруцелл.

Получен также штамм. МКА которого позволяют дифференцировать Bruceila от Yersinia enterocolitica 0-9

Антигенные свойства белков внешней мембраны (БВМ) Bruceila начали изучаться сравнительно недавно Имеющиеся данные свидетельствуют об иммуногенности БВМ и

возможности использования их в качестве протективного антигена в создании вакцин. Перспективность белковых антигенов в конструировании вакцинных препаратов объясняется тем, что они могут быть легче синтезированы или получены методом ре- комбинантной ДНК (генетической инженерии) в достаточном количестве, чем компоненты ЛПС.

Кроме того, установлено, что за перекрестные реакции, отмечаемые между Bruceila и другими микроорганизмами, ответственны не белковые, а полисахаридные антигены. МКА, направленные к белковым антигенам бруцелл, особенно к БВМ, могут быть незаменимым инструментами в разработке как диагностических, так и профилактических препаратов.

Известны клоны гибридных клеток Bruce 5 и Bruce б, вырабатывающие МКА к белкам клеточной стенки Bruceila. Гибридо- мы были получены путем слияния спленоцитов мышей BALB/c, иммунизированных инактивированными клетками Brucella abortus с миеломной линией NC-1. МКА этих гибридом реагировали с ультразвуковым дезинтегратом клеток, но не связыва- лись с ЛПС и не обладали способностью агглютинировать бруцелл, Это свойство дает основание отнести МКА Bruce 5 и Bruce 6 к белокспецифическим антителам.

Известна гибридома - А23, продуциру- ющая МКА к БВМ Brucella. МКА клона А23 взаимодействовали с имтактными клетками в твердофазном иммуноферментном анализе (ТИФА), но не проявляли активность по отношению к ЛПС. На основании этих дан- ных можно сделать вывод, что данный клон продуцирует МКА, специфичные к эпитопу белка. В приведенных работах не установлена молекулярная масса, антигенность и другие свойства белков, против которых получены МКА, вырабатываемые упомянутыми гибридомами,

Целью изобретения является получение штамма гибридных клеток мыши, продуцирующих МКА к БВМ бактерии рода Brucella с мол, м. 14 КД.

Штамм получают следующим образом.

Мышам линии BALB/c в первый день иммунизации внутрибрюшинно вводят 100 мкг БВМ, полученного из Brucella melltensls 16М, в 0,1 мл неполного адьюванта Фрейд- на. На 7. 11, 12 и 13-й дни иммунизации животным инъецируют по 100 мкг антигена в забуференном физиологическом растворе (ЗФР), рН 7,2-7,4. Спустя 4 дня после по- следней иммунизации извлекают селезенку с тех мышей, которые дают более высокие титры антител по ТИФА, Клетки селезенки иммунных мышей в количестве 20х10б гиб- ридизуют с 2х106 клетками миеломы Х63- Ад8-5.6.3 в присутствии 1 мл раствора, содержащего 45% (объем на объем) полиэти- ленгликоля с мол. м. 4000 и 10% диме- тилсульфооксида в течение 1 мин. После гибридизации и отмывки клеток от полиэти- ленгликоля их высевают в ячейки 96-луноч- ной панели.

Селекцию гибридных клеток проводят на среде, содержащей гипоксантин-ами- ноптерин-тимидин.. Гибриды-продуценты клонируют два раза методом лимитирующих разведений, высевая в ячейки 96-лу- ночной панели с питающим слоем перито- неальны макрофагов мыши. После второго клонирования практически 100% субклонов продуцируют антитела к тестируемому антигену. Продуктивный клон гибридомы обозначают 1 СЗ Н4.

Штамм гибридомы 1 СЗ Н4 хранится в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК(П)518Д и характеризуется следующими свойствами.

Морфологическая характеристика. Культура состоит из слабоприкрепляющихся к подложке округлых клеток размером с исходную миеломную клетку Ядро занимает большую часть клетки. Цитоплазма имеет вид тонкого ободка.

Культуральные свойства. Среда культивирования - RPMI-1640 с 10% фетальной СЫВОРОТКИ теленка, 2x10 М глютамина, 1x10 М пирувата натрия, М 2-мер- каптозтанола, 1x10 HEPES. Культивирование штамма ведут при 37,5°С в атмосфере с 5% С02. Характер роста - стационарная сус- пенз ия, Частота пассирования - через 2-3 сут, кратность рассева 1:3-1:4. Посевная концентрация клеток 1-2хЮ5 в 1 мл. Наибольшее число клеток в логарифмической фазе роста 0,5 млн/мл.

При внутрибрюшинной прививке мышам гибридомы образуют опухоль в асцит- ной форме на 10-12-й день. Доза клеток при прививке 2x10 клеток. За 7 дней до введения гибридомы необходимо инъецировать животным пристан-2, 6, 10,14-тетраметил- пентадекан в дозе 0,5 мл на голову, К моменту депонирования штамм прошел 5 пассажей на мышах BALB/c.

Продуктивность штамма. На 3-4-й день культивирования гибридомы секреция МКА достигается 35-45 мкг/мл в культуральной среде. В асцитной жидкости концентрация иммуноглобулинов составляет 7-8 мг/мл. Количество последней от одной мыши 4- 8 мл.

Характеристика полезного продукта. МКА относятся к классу IgG подкласса 1. Оно специфично к антигенной детерминанте БВМ бруцелл с мол, м. 14 кД При электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додециосульфата натрия МКА разделяются на Н и L цепи с мол м, 60 и 20 КД соответственно. Константа связывания 2x10 М,

Методы оценки специфичности МКА: непрямой и сэндвич варианты ТИФА, им- муноблот.

Контаминация штамма Контаминатов линии, включая бактерии, грибов, дрожжей и микоплазм не обнаружено,

Криоконсервация, К осадку гибридных клеток добавляют фетальной сыворотки теленка и диметилсульфооксида до конечной концентрации 10% Суспензию клеток разливают в стерильные пластиковые ампулы с завинчивающимися крышками по 1--5 млн. кл., помещают в коробку из пенопласта и

ставят на 1 сут в морозильник при -70°С, после чего ампулы переносят в жидкий азот.

Условия размораживания. Замороженные клетки штамма вынимают из сосуда с жидким азотом м быстро помещают в водяную баню на 37°С. Как только растают последние кусочки льда, суспензию гибридомы переносят стерильной пипеткой в центрифужную пробирку, содержащую 10 мл холодной бессывороточной среды, отмывают один раз и засевают в ячейки 24-луночной панели с питающим слоем перитонеальных макрофагов. Выживаемость при размораживании 85%.

Штамм 1 СЗ Н4 используют следующим образом,

Пример 1. Гибридные клетки помещают в пластиковый флакон площадью 25 см по 5 х 105 в 5 мл среды культивирования, инкубируют 3-4 дня при 37,5°С в атмосфере, содержащей 5% С02. Культуральную среду собирают, центрифугируют 10 мин при 800 g и 4°С с целью отделения клеток надосадочной жидкости - супенатанта, содержащего антитела. При культивировании гибридомы In vivo иммуноглобулиновую фракцию на асцитной жидкости получают высаливанием белков сульфатом аммония 45%-ного насыщения с последующим диализом против ЗФР (рН 7,2-7,4) при 4°С в течение ночи Полученные антителосодер- жащие материалы (супернатант и очищенную асцитную жидкость) используют как реагенты для изучения специфичности взаимодействия МКА с тестируемыми антиге1- нами.

П р и м е р 2. Для проведения непрямого варианта ТИФА на полистироловую 96-лу- ночную панель для микротитрования сорбируют интактные клетки микроорганизмов в концентрации 1 х 107 кл/мл или БВМ бру- целл по 10 мкг/мл в 100 мкл ЗФР.рН 7,2-7,4 при 4°С в течение ночи Затем панель отмывают 3 раза ЗФР с 0,05%-ным твином-20 (ЗФР-ТВ) и 3 раза ЗФР, готовят в ячейках панели двукратные разведения супернатан- та (1.2 и выше) и очищенной асцитной жидкости (1.100 и выше) в объеме 100 мкл ЗФР-Тв После инкубации в течение 1,5 ч при 37°С панель отмывают описанным способом и вносят в ячейки антитела кролика против иммуноглобулинов мыши, меченные пероксидазой. Через 1 ч повторяют процедуру отмывки с целью удаления несвязанных продуктов реакции, а связавшуюся пероксидазу, а значит, и антитела против антигена бактерий определяют количественно по расщеплению субстрата -НаОз в присутствии хромогена - оргофенилендиамина. Положительная реакция характеризуется

коричневым окрашиванием и просчитыва ется при 492 нм.

Результаты опыта по определению специфичности МКА в непрямом варианте ТИ- 5 ФА представлены в табл. 1

Как видно из табл. 1, МКА штамма 1 СЗ Н4 взаимодействуют с БВМ трех использованных видов бруцелл. Причем титры МКА против Brucella abortus шт. 19 и Brucella suis

0 шт. 1330 выше, чем против вида Brucella melltensls 16M, использованного для иммунизации мышей. Следует отметить, что МКА, специфичные к БВМ бруцелл, не реагируют с аналогичным антигеном бактерии Yerslnia

5 enterocolltlka 0:9, который, как известно, серологически не отличаются от Brucella.

Как следовательно ожидать, испытуемые МКА не связывались с ЛПС бруцелл. Титры МКА против интактных бактерий бы0 ли ниже и определялись они только при исследовании асцитной жидкости, что объясняется малой концентрацией специфического антигена, адсорбированного твердой фазой полистиролового носителя, в случае исполь5 зования суспензии клеток.

П р и м е р 3. На полистироловую 96-лу- ночную панель для микротитрования сЪрби- руют МКА из асцитной жидкости (20 мкг/мл), очищенной высаливанием сульфатом аммо0 ния.в 100 мкл бикарбонатного буфера (рН 9,5) при 4°С в течение ночи. Затем панель отмывают по три раза ЗФР-Тв и ЗФР, вносят в ячейки БВМ бруцелл в концентрации 5 мкг/мл в ЗФР-Тв и инкубируют 1,5ч при 37°С. Панель

5 отмывают описанным способом, готовят в ячейках двукратные разведения биофабричной позитивной бруцеллезной сыворотки крупного рогатого скота, имеющей титр в реакции агглютинации 1:600, в ЗФР-Тв

0 (1.100 и выше). В качестве отрицательного контроля использовали негативную сыворотку этого же вида животного. После выдерживания панели при 37°С в течение 1,5 ч повторяют процедуру отмывки и в ячейки

5 вносят антивидовые антитела, меченные пероксидазой. Концентрацию связавшихся антител определяют по примеру 2.

Результаты исследований приведены в табл, 2.

0 Приведенные данные свидетельствуют не только о специфичности МКА, но и анти- генности белков захваченных антителами штамма 1 СЗ Н4, а также возможности использования этой тест-системы в разработ5 ке методов диагностики бруцеллеза.

П р и м е р 4. Постановка иммуноблота. Образцы БВМ различных видов бруцелл в количестве 10 мкг подвергают электрофорезу в 10%-ном полиакриламидом геле в присутствии додецилсульфата натрия.

Электрофореграмму переносят на нитро- целлюлозную бумагу в течение 1 ч при 60 В и 250 мА. Свободные участки носителя блокируют 1%-ным бычьим сывороточным альбумином в ЗФР, рН 7,2-7,4 (18 ч при 4°С), затем отмывают по три раза ЗФР и инкубируют 1,5 ч при 37°С с МКА из очищенной асцитной жидкости, разведенной 1:100, ЗФР-Тв. После этого носитель отмывают три раза ЗФР-Тв и ЗФР, затем его выдерживают в рабочем разведении антимышиных антител, меченных пероксидазой (1 ч при 37°С). Повторяют процедуру отмывки и проявляют реакцию с помощью 4-хлор-1- нафтола.

Примечание, РО - реакция отрицательная.

5

При электрофорезе БВМ Brucella abortus шт, 19, Brucella melltensls шт. 16М и 565, Brucella suls шт. 1330 разделяли на 4 фракции с мол. м. 48; 41-43; 23; 14 кД. Им- мунохимическое выявление специфического белка, выполненное по примеру 4, показало, что МКА, продуцируемые штаммом гибридомы 1 СЗ Н4, направлены против детерминанты БВМ с мол. м, 14 кД. Формул а изо бретен ия Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. ВСКК (П) 518Д, используемый для получения моно- клональных антител к белку внешней мембраны бактерий рода Brucella с мол, м. 14 кД.

Таблица 1

Таблица 2