ВОДНЫЙ ЭКСТРАКТ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ, ОБЛАДАЮЩИЙ ПРОТИВОМИКРОБНОЙ, ФАГОЦИТАРНОЙ, МИТОТИЧЕСКОЙ И АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 1998 года по МПК A61K35/78 

Изобретение относится к области медицины и медицинской промышленности и может быть использовано для получения нового биологически активного вещества (БАВ), которое является препаратом противовоспалительного действия, обусловленного его противомикробной, фагоцитарной, митотической и антиоксидантной активностью.

Известны препараты, обладающие противовоспалительной активностью, полученные химическим синтезом: трихопол, фуродонин, тимидозол, аспирин и т.д. (см. М.Д. Машковский, М., 1978).

Наиболее эффективными в плане противовоспалительного действия являются синтетические антиоксиданты - производные ионолового ряда - феназан K⁺ и Z^-.

Общим недостатком химических препаратов является их высокая токсичность.

Менее токсичным является ДМСО - диметилсульфоксид, препарат, обладающий антиоксидантными свойствами, применяемый в качестве противовоспалительного средства. Особенно эффективен ДМСО в комплексе с гормональными (стероидного типа) препаратами.

Недостатком данного аналога является низкая эффективность в отсутствии комплекса с гормоном. Вместе с тем включение в схему лечения гормонов часто имеет побочные явления: увеличение жесткости клеточных мембран, нарушение их проводимости, ломкость и т.д.

Этих недостатков лишены экстракты из растительного сырья, но препараты естественного происхождения имеют, как правило, низкую эффективность в сравнении с первой группой веществ.

Расширение спектра лекарственных препаратов противовоспалительного действия является постоянно актуальной задачей фармацевтической промышленности, прикладных исследований в области медицины.

Таким образом, техническим результатом предлагаемого изобретения является расширение спектра БАВ, обладающих противовоспалительным действием.

В основу решения положены исследования Виталия Васильевича Караваева по прямой экстракции растительного сырья в воду.

Технический результат достигается за счет того, что водный экстракт получают прямой экстракцией растительного сырья в воду, полученный экстракт фильтруют. В качестве растительного сырья, взятого на 1 л воды, используют смесь, содержащую, г:
Траву полыни горькой - 10
Траву мяты перечной - 10
Почки сосны обыкновенной - 12
Корень солодки - 1
Траву зверобоя продырявленного - 5
Траву чабреца - 5
Цветы тысячелистника - 5
Цветы календулы - 5
Траву чистотела - 5
Автору не удалось из доступной литературы выявить состав сбора трав, аналогичный используемому для получения биологически активного вещества, обладающего противомикробной, фагоцитарной, митотической и антиоксидантной активностью.

Из этого автор делает вывод о соответствии предложения критериям изобретения: промышленная применимость, новизна и изобретательский уровень.

I. Исследование биологической активности БАВ
1. Исследование противомикробной активности
Исследования проводили на музейных культурах микроорганизмов: St.aureus, Echer.coli, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeroginosa, Saemonella typhnerium, Schigella flexneri и кишечная палочка 0-138. За трое суток до начала работы культуры пересевались на ЖСА, через 48 ч колонии откладывались на МПА и инкубировались в течение 24 ч при 37^oC в термостате.

Для проведения исследования противомикробной активности препарата микроорганизмы пересевались на чашки Петри с питательной средой и инкубировались в течение ночи до появления на чашках большого числа микробных колоний.

Исследуемый препарат в количестве 0,02 наносился на чашку Петри поверх микробных колоний откалиброванной бактериологической петлей, и чашки инкубировались в течение 2-х суток.

Результат учитывался по появившимся пятнам лизированных микроорганизмов. В качестве контроля использовались интактные чашки с музейной культурой микроорганизмов без воздействия препарата. Было проведено 5 серий исследований, в результате которых было установлено, что нативный препарат обладает выраженной антибактериальной активностью в отношении всех исследовавшихся микроорганизмов.

2. Исследование влияния растительного экстракта БАВ на фагоцитарную активность элементов крови
Исследование проводилось на нейтрофилах крови (тест НСТ)
Суть теста состоит в том, что способные к фагоцитарной активности клетки крови захватывают частички красителя - нитротетразолиевого синего. Количество нейтрофилов, захвативших краситель, является показателем активности крови.

В качестве субстрата для получения нейтрофилов использовалась донорская кровь. Кровь в стерильных условиях забиралась из локтевой вены, гепаринизировалась по общепринятой методике и затем в течение часа с момента ее получения проводился тест НСТ.

В качестве стандартов сравнения активности исследуемого препарата использовались известные индукторы - фагоцитоза-лизоцим и предигиозан.

В иммунологический планшет помещали по 0,05 мл гепаринизированной крови. В контрольную лунку (для проверки спонтанной активности) добавляли 0,225 мл раствора Хэнкса, в лунки для сравнения со стандартными препаратами по 0,025 мл раствора продигиозана и лизоцима, в остальные лунки добавлялся исследуемый препарат в концентрации 50, 10, 1% на солевом растворе Хэнкса. Также в одну из лунок с кровью добавляли 0,025 мл среды 199 в качестве контроля растворителя.

Затем во все исследуемые лунки добавляли по 0,025 мл 0,02% раствора НСТ. Содержимое лунок в планшете пипетировали при помощи микропипеток и инкубировали при 37^oC в течение 15 мин. После этого повторно пипетировали и инкубировали в термостате в течение 30 мин.

Затем готовили мазки крови на обезжиренных предметных стеклах, высушивали мазки на воздухе, фиксировали в течение 10 мин в смеси метилового и этилового спиртов, окрашивали кармином в течение 1 ч.

В полученных и окрашенных мазках подсчитывали отношение числа нейтрофилов, которые захватил краситель, к общему числу нейтрофилов в мазке (из 100 клеток). Полученные результаты статистически обрабатывались. Данные приведены в табл. 2.

Исследуемый препарат во всех концентрациях (50, 10, 1%) усиливал фагоцитарную, статистически достоверную активность нейтрофилов в 2,73-3,05 раза по сравнению со спонтанной, в зависимости от концентрации. БАВ является активным стимулятором процесса фагоцитоза, он может применяться при различных состояниях и заболеваниях, протекающих со снижением клеточного иммунитета.

3. Изучение актиоксидантной активности БАВ
Исследование проводилось на нейтрофилах крови. Индуцировался зимозаном процесс кислородного взрыва и исследовался процесс его ингибирования исследуемым препаратом.

Препараты: ингибирующие индуцированный кислородный взрыв, по литературным данным обладают антиоксидантной и противовоспалительной активностью.

Исследование проводилось на цельной крови донора. Гепаринизированная кровь, полученная из локтевой вены, в количестве 0,1 мл добавлялась в анализатор хемолюминометра, затем добавлялось по 0,1 мл растворов люминола и зимозана (для индуцированного кислородного взрыва в нейтрофилах крови).

В клетках крови нарастал кислородный взрыв, что регистрировалось по увеличению хемолюминисценции. На пике кислородного взрыва в анализатор вводился препарат в конечной концентрации 0,5% и замерялось изменение люминисценции. Контролем служила кровь, к которой не добавлялся препарат. Было установлено, что добавление в количестве 0,015 мл препарата к крови практически полностью ингибировало кислородный взрыв в клетках, что можно расценивать как ингибирование АФК - активных форм кислорода, участвующих в механизме перекисного окисления липидов и развития окислительной реакции (см. чертеж).

В результате двух серий измерений было установлено, что БАВ достоверно ингибирует в клетках крови активные формы кислорода, участвующие в воспалительных реакциях в организме. Фоновая люминисценция сыворотки крови и препарата ничтожно мала и не влияет на полученный результат. Так как растительный экстракт БАВ достоверно ингибирует индуцированный зимозаном кислородный взрыв, его можно отнести к группе препаратов, обладающих антиоксидантной, противовоспалительной активностью, и он может быть использован в качестве профилактического средства при воздействии повышенных температур.

4. Изучение митотической активности БАВ.

Изучение митотической активности проводилось методом биоиндикации на перевиваемой клеточной линии PH.

Клеточная взвесь (концентрация клеток 80 тысяч в 1 мл культуральной среды) рассаживалась по пенициллиновым флаконам с кусочками покровных стекол на дне. В качестве культуральной среды использовалась среда 199 с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота. После сформирования клеточного монослоя культуральная среда сливалась и заменялась на раствор препаратов в среде 199. Для исследования митотической активности были использованы нетоксичные концентрации препарата БАВ - 0,5% раствор. Контролем служила клеточная культура без добавления препаратов, флаконы инкубировались в термостате при 37^oC в течение 48 ч, каждые 24 ч готовились морфологические препараты по общепринятой методике и проводился подсчет числа митотических клеток в монослое методом случайных полей по морфологической сетке Стефанова С.Б.

Митотический индекс выражался в отношении числа митотических клеток к числу монослоя (на 1000 клеток).

Было проведено 5 серий исследований. Митотический индекс контрольной клеточной линии pH составляет 20,5 митотических клеток на 1000 исследуемых.

Использование БАВ во всех 5 сериях сопровождалось достоверным в 2,34 раза увеличением митотической активности клеток по сравнению с контрольной культурой. Увеличивая митотическую активность клеток БАВ улучшает репаративные процессы кожи (табл.3).

Проведенные исследования позволили установить, что БАВ оказывает противомикробное действие, являясь активным стимулятором процесса фагоцитоза и может быть использован при различных состояниях, связанных со снижением клеточного иммунитета.

Растительный экстракт БАВ может быть отнесен к группе веществ, обладающих антиоксидантной и противовоспалительной активностью. За счет митотической активности клеток улучшает репаративные процессы кожи.

II. Исследование безопасности накожного применения БАВ.

1. Изучение острой токсичности БАВ
Изучение острой токсичности БАВ проводилось методом биоиндикации на клеточной линии Л-41-лейкоциты человека.

Клеточная суспензия рассаживалась в пенициллиновые флаконы с покровным стеклом (концентрация клеток - 80 тыс. в мл, культуральная среда - 199 с добавлением сыворотки крупного рогатого скота). Флаконы инкубировались в термостате при 37^oC в течение 24 ч до формирования на стеклах клеточного монослоя. Затем культурная среда сливалась и заменялась на поддерживающую среду 199 без сыворотки.

Разведение БАВ готовили в среде 199 в различных концентрациях от 0,1 до 10% и нативного.

Различные концентрации препарата добавлялись в культуральную среду и инкубировались в течение 72 ч в термостате, каждые 24 ч готовились морфологические препараты по общепринятой методике: фиксация жидкостью Карнуа, окраска гематоксилин-эозином.

Контролем служила клеточная культура, в которую не добавлялось БАВ, и культура, в которую добавлялось подсолнечное масло.

Исследования показали, что БАВ не токсично для клеточного монослоя в концентрациях от 0,1 до 0,5%. Клетки хорошо распластаны на стенке, цитоплазма мелкозернистая, ядра правильной формы, округлой с 1-3 крышками, имеется много митотических клеток.

В концентрациях от 1 до 3% проявляется слабая цитотоксичность: происходит разрежение монослоя, цитоплазма клеток вакуолизирована, встречаются отдельные пикнотизированные клетки.

В концентрации от 3 до 10% токсичность препарата для клеточного слоя значительно возрастает, появляется от 50 до 70% от общего числа погибших клеток.

2. Исследование хронической токсичности БАВ методом биоиндикации на клеточной линии Л-41-лейкоциты человека.

Для проведения исследования брали культуральный сосуд объемом 175 мл со сформированным клеточным монослоем. Монослой снимали со стекла раствором Версена, клетки суспендировали в культуральной среде 199 таким образом, чтобы концентрация в 1 мл среды составляла 100 тыс.клеток.

Полученная суспензия использовалась для проведения опыта в следующих вариантах:
а) В 2-е чашки Карреля объемом 25 мл помещали 5 мл клеточной взвеси, затем в одну добавляли 5 мл среды 199 с 10% сыворотки крупного рогатого скота, а во вторую 5 мл среды 199, содержащей 0,16% исследуемого препарата и сыворотку.

Таким образом, препарат разводился до концентрации 0,08%. Обе чашки Карреля инкубировали в термостате при 37^oC без смены среды до полной дегенерации клеточного монослоя.

Время инкубации составило 16 суток как для контрольного, так и испытуемого монослоя.

б) В 2-е чашки Карреля объемом 25 мл помещали 5 мл клеточной взвеси, затем в одну добавляли 5 мл среды 199, а в другую 5 мл 0,26% раствора препарата в среде 199. В обе чашки добавляли сыворотку крупного рогатого скота в количестве 5%. Замену культуральной среды в обеих чашках проводили каждые 2 дня. Длительность выживания монослоя составляла 21 день как в контрольной чашке, так и в опытной. Разница в длительности выживания клеточного монослоя между первым и вторым вариантом получена за счет введения во втором варианте питательной среды каждые два дня.

Проводилось ежедневное прижизненное наблюдение за состоянием монослоя, отклонений от морфологий монослоя не обнаружено.

в) 10 мл взвеси помещали в культуральный сосуд емкостью 175 мл, добавляли 10 мл среды 199, содержащей 0,16% исследуемого препарата и 10% сыворотки крупного рогатого скота. Сосуд инкубировали в термостате при 37^oC в течение 72 ч до формирования клеточного монослоя. В дальнейшем каждые двое суток проводили отсадку ткани в пенициллиновые флаконы с покровными стеклами с целью приготовления морфологических препаратов (фиксация этиловым спиртом в течение 10 мин, окраска гематоксилин-эозином). Длительность исследований составила 10 пассажей (в каждом пассаже 16 флаконов).

г) Клеточная взвесь инкубировалась в течение 72 ч до формирования монослоя. Затем клетки снимались со стекла раствором Версена и рассаживались в пенициллиновые флаконы. В 16 флаконах в качестве культуральной среды использовали среду 199 с 10% сыворотки (контрольная группа) и в 16-ти флаконах 0,08% раствор исследуемого препарата в среде 199 с сывороткой. Флаконы инкубировали в термостате, морфологические препараты готовились каждые 24 ч. Всего провели 5 серий исследований. Ни в одном варианте исследования не обнаружено отклонений в морфологии: отсутствуют патологические митозы, количество многоядерных (3,3) и гигантско-ядерных клеток (5,5 на 100) не превышает норм для данной клеточной линии, отсутствует неспецифическая дегенерация.

БАВ в используемый концентратами не нарушает жизненных функций клеточного монослоя при длительном введении в питательную среду ни в одном из вариантов исследования.

В результате проведенных исследований установлено, что БАВ нетоксичен и не оказывает цитопатического действия на клеточный монослой в концентрации 0,5% и ниже, так как исследование фармакологических препаратов на клеточном монослое приравнивается к модели внутривенного введения, то при пересчете на 1 кг биомассы человека доза БАВ составит около 17,2 л. Следовательно, БАВ можно отнести к нетоксичным веществам.

III. Исследование местнораздражающих свойств БАВ.

Экспериментальные исследования проведены на 40 белых беспородных крысах (самцы, масса тела 180-200 г) и 10 кроликах породы шиншилла (самки, масса тела 2,5-3,0 кг). Исследуемый БАВ вводили животным различными способами в нативном виде.

I. Исследование местнораздражающего действия БАВ на крысах путем накожных аппликаций.

Исследования были проведены на 20 беспородных крысах (самцы, масса тела 180-200 г), которые были разделены на две группы по 10 животных в каждой: 1-я группа - контроль (основа БАВ), 2-я группа - БАВ.

БАВ и его основу наносили на депиллированную кожу спины крыс размером 2,0х2,0 см по 1 мл ежедневно в течение 30 суток. По окончании эксперимента проведена эвтаназия животных и визуально была исследована кожа и подкожная клетчатка в месте нанесения БАВ и основы. При установлении выраженной реакции кожи и подкожной клетчатки в виде гиперемии или усилении сосудистого рисунка делался вывод о наличии раздражающего действия БАВ.

В результате проведенных исследований было установлено, что в условиях длительной аппликации БАВ кожи крыс не зарегистрировано гиперемии или усиления сосудистого рисунка на коже и подкожной клетчатке, что свидетельствует об отсутствии раздражающего действия у БАВ.

2. Изучение местнораздражающих свойств БАВ при повторном подкожном введении крысам
Исследования проведены на 20 белых беспородных крысах (самцы, масса тела 180-200 г), которые были разделены на 2 группы по 10 животных в каждой: 1-я группа - контроль (основа БАВ), вторая группа - БАВ.

Исследуемое БАВ и его основу вводили крысам трехратно подкожно в объеме 0,5 мл на животное. По окончании эксперимента была проведена эвтаназия животных. Оценка раздражающих свойств БАВ и его основы проведена аналогично описанной в разделе 1.

В результате проведенных исследований установлено, что БАВ и его основа не вызвали видимых изменений кожи и подкожной клетчатки в месте введения препарата.

3. Оценка местнораздражающих свойств БАВ при субконъюктивальном введении кроликам
Исследования выполнены на 10 кроликах породы шиншилла (самки, масса тела 2,5-3,0 кг), которые были распределены на 2 группы по 5 животных в каждой: 1-я группа - контроль (основа БАВ), 2-я группа - БАВ).

Исследуемый БАВ и его основу вводили кроликам трехкратно в количестве 0,02 мл на каждое животное в левый глаз, правый глаз при этом был контрольным.

Проведенные исследования свидетельствуют об отсутствии раздражающего действия исследуемого БАВ и его основы на слизистую кроликов в условиях субконъюктивального введения.

Таким образом, изучение токсичности БАВ и его местнораздражающего действия позволило установить, что:
1. В условиях длительной аппликации БАВ, содержащий водный экстракт растительного сырья на депиллированную кожу крыс отсутствуют видимые изменения кожи и подкожной клетчатки экспериментальных животных.

2. При трехкратном введении крысам БАВ не зарегистрировано раздражающего действия препарата в месте инъекции.

3. БАВ на основе водного экстракта растительного сырья не обладает раздражающим эффектом на слизистую оболочку глаз кроликов при повторном субконъюктивальном введении.

Проведенные исследования позволяют оценить БАВ как перспективное средство для противовоспалительной терапии, не имеющее побочного действия.

Препарат проходит клинические испытания.

Водный экстракт растительного сырья обладающий противомикробной, фагоцитарной, митотической и антиоксидантной активностью. Изобретение относится к области медицины и медицинской промышленности. С целью расширения спектра биологически активных веществ, обладающих противовоспалительным действием, проводят прямую экстракцию в воду из растительного сырья, содержащего сбор: травы полыни горькой, зверобоя, чебреца, тысячелистника, чистотела, корня солодки, почек сосны, листа мяты, цветов календулы. В полученный продукт добавляют фармацевтически приемлемые компоненты. 4 табл.

Водный экстракт растительного сырья, обладающий противомикробной, фагоцитарной, митотической и антиоксидантной активностью, представляющий собой фильтрат, полученный экстракцией смеси растительного сырья: травы полыни горькой (Herba Artemisiae amsinthi), травы мяты перечной (Herba Menthae piperitae), почек сосны обыкновенной (Gemmae Pini sylvestris), корня солодки (Radix Glycyrrhizae), травы зверобоя продырявленного (Herba Hyperici perforati), травы чебреца (Herba Jhym), цветов тысячелистника обыкновенного (Flores Achilleae millefolium), цветов календулы лекарственной (Flores Calendulae officinalis), травы чистотела большого (Herba Chelionii majoris) водой, при следующем соотношении компонентов, г/л.:
Трава полыни горькой - 10
Трава мяты перечной - 10
Почки сосны обыкновенной - 12
Корень солодки - 1
Трава зверобоя продырявленного - 5
Трава чабреца - 5
Цветы тысячелистника обыкновенного - 5
Цветы календулы лекарственной - 5
Трава чистотела большого - 5
Вода - До 1 л,